[摘要]干扰素作为21世纪抗病毒、抗癌症最为广泛的药物之一,在临床应用的需求量越来越高,如何使基因工程干扰素大规模产业化生产成为了重要课题。要使干扰素得到大量高效的合成，还需要对基因工程干扰素生产的每一个环节作进一步的完善：选择一个高效的载体-宿主系统；设计一个适于工程菌生产和干扰素表达的培养基处方；发酵工艺的优化等。
[关键词] 干扰素 研究意义 载体-宿主系统 培养基 发酵 纯化 发展前景
一.前言
干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物活性的蛋白质,在疾病诊断预防和治疗中有重要价值,受到医学界、生物界的极大重视,传统的从动物中提取血源性干扰素由于来源有限及技术资金方面问题而无法大量合成已经是过去了,随着生物技术的发展,通过先进的DNA重组技术,可以在人体外大规模生产干扰素,基因工程干扰素具有无污染,安全性高,纯度高,比活性高,成本低,疗效确切等优点。如今临床应用的需求量越来越高，如何使基因工程干扰素大规模产业化生产成为了重要课题。想要推广干扰素的使用,必须建立高效生产干扰素的体系[1]。
二.干扰素简介
干扰素是一种细胞因子。它是机体感染病毒时, 宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构相似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素干扰病毒复制, 它是机体抗病毒感染的防御系统干扰素的种类很多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。[3]目前所知道的人体干扰素按细胞结构和来源分α、β、γ干扰素三个型别, α干扰素又称人白细胞干扰素，它是由B淋巴细胞和单核细胞产生的,它可以分为23种亚型[2],分别称为干扰素α1、α2a、α2b、α3等，它们相互之间有较高的同源性[2]。人β-干扰素又称人纤维母细胞产生的, 只有一个亚型。γ一干扰素又称免疫干扰素,它是由淋巴细胞的辅助诱导细胞产生的,与α、β干扰素之间没有明显的同源性。三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性。基因工程干扰素是指从人细胞中克隆出干扰素基因, 将此基因与大肠杆菌表达载体连接物构成重组表达质粒, 然后转化到大肠杆菌中, 从而获得高效表达人干扰素蛋白的工程菌, 工程菌经发酵后可收集到大量菌体, 将菌体破裂, 用先进的生物工程手段将干扰素蛋白从菌体分离、纯化，得到高纯度的人基因工程干扰素。基因工程干扰素的出现, 是干扰素研究工作的一项重大突破它使得干扰素能进人大规模产业化生产,人们能获得大量活性高、疗效好的干扰素[3]。
三.干扰素的研究意义
近年来在国际上抗病毒和抗癌症的研究领域中,更多地在开发自然的免疫调节和抗病毒物质,干扰素作为一种天然的人体抗病毒蛋白质受到人们的关注。干扰素将要成为21世纪抗病毒、抗癌症最为广泛的药物之一[4]。α一干扰素是迄今为止治疗慢性乙肝的首选抗病毒药物, 一般肝炎治疗药物的显效率在20%-30%左右。干扰素代表了慢性肝炎药物发展的方向。它还是治疗丙肝的唯一有效抗病毒药物, 它又是临床上应用最广的治疗肿瘤的细胞因子。它的适应症主要有病毒性皮肤性病、慢性子宫颈炎、呼吸道病毒感染及妇科疾病、疙疹、造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤。β-干扰素用于复发的多发性硬化症，用于静脉注射使用。γ-干扰素主要治疗类风湿性关节炎。γ-干扰素在免疫调节功能方面较α、β-干扰素强1000倍, 不仅可以增强免疫功能, 还可以调整自身免疫性疾病免疫过渡到接近正常水平[3]。干扰素还应用于生殖道衣原体感染、浅表膀胱癌、尖锐湿疣、皮肤病、血液系统疾病、艾滋病相关综合征等的治疗。世界上已有许多国家批准生产使用重组干扰素制剂,用于治疗多种疾病。经过临床应用治疗表明,用干扰素治疗,一般无严重副反应.临床上正在不断开发新的适应症以扩大干扰素的使用[1]。
四.干扰素的优化生产
对于基因工程干扰素在产业化生产中的几大影响因素,我们应该掌握其原理,尽可能改善工艺,达到优化的产业化生产干扰素。
(1)高效的载体宿主系统
用作重组的表达载体需要具备以下性质:很强的启动子, 能为宿主的RNA聚合酶所识别;很强的终止子, 以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的基因, 而不去转录其他的基因;启动子必须受控制, 只有当诱导时才能被转录;所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号, 即AUG和S-D序列.表达载体的启动子种类很多, 使用最多的启动子是λ噬菌体的pL和pR启动子, 它们不但启动子强度高, 而且受基因产物的严格控制.尤其是利用CI温度敏感突变株十分方便, 当温度在30℃生长时, CI阻遏蛋白牢牢地阻遏启动子, 把温度提高到40-42℃时, 则立即消除阻遏, 从pL或pR进行大量的转录并翻译.在干扰素生产过程中, 在30℃发酵8h, 在42℃发酵2h诱导表达即可.表达产物形成包涵体, 优点在于表达稳定、量多, 缺点是恢复蛋白质的天然结构才能充分地显示生物活力。
常在基因工程干扰素的生产中用大肠杆菌做宿主细胞。将干扰素序列精确定位于大肠杆菌的乳糖启动子附近提高表达效率1000倍以上。
(2)工程菌发酵培养基
为实现外源基因的高效表达, 工程菌的培养技术也是非常重要的, 工程菌发酵培养基的组成和配比不仅要满足工程菌生长代谢需要, 还要利于目的的产物的表达, 即使同一组分对于工程菌的生产和目的产物表达的影响也有所差异, 因而在优化过程中, 要抓住主要因素, 根据实际需要进行取舍。
(3)干扰素发酵工艺
传统的细菌培养方式通过手控调整搅拌速度和通气量,会导致细菌生长环境的突然改变,影响工程菌的生长繁殖而我国自行设计的适应工程菌发酵的程序控制法,在培养基菌种、PH、温度等条件不变的情况下,可自动调节工程菌生长繁殖的最佳条件,其环境变化温和、平稳,有利于工程菌的生长繁殖另外,以往的批式培养在工程菌生长繁殖的对数期营养物质已基本耗尽,细菌生长速度减慢,对数期随之缩短,很快进人稳定期-衰亡期,而流加式培养补充了营养物质,延长了对数期因此,提高了菌体的产量和干扰素表达量。
(4)干扰素纯化工艺
干扰素纯化是干扰素领域的一个重要课题在制定具体的纯化路线时, 首先要了解纯化的干扰素与杂质之间在理化、生物学方面的差异,然后进行纯化工艺的设计离子交换柱层析和疏水相互作用层析由于具有处理量大、分辨效果高的特点,常用作首选分离介质这两种方法的区别是离子交换柱层析要求低离子强度上样而疏水相互作用层析要求高离子强度上样固相金属亲和离子层析和单克隆抗体亲和层析分辨率高常用在干扰素表达量低,杂质与干扰素的理化性质接近的情况,一般处于整个纯化工艺的中间步骤凝胶过滤法层析处理量小,回收率高, 常用作纯化工艺的最后一步,用于转换溶液系统或去处与目标蛋白相距较远的杂蛋白[3]。如α—IFN提纯工作中,为了提高重组人干扰素α2b 的质量,增加产量,降低成本,通过酵培养,破菌,包涵体提取,离子交换层析,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达95 %以上,比活达到1.2×108 IU/ mg 以上。采用此方法收率高,纯度好,工艺稳定,适合大规模生产[5]。
下面以大肠杆菌表达生产重组人干扰素-γ为例对优化生产过程作介绍:
以常数和可变比生长速率进行分批补料发酵工艺，用于对表达人干扰素-γ(hIFN-γ)的大肠杆菌BL21(DE3)进行高细胞密度培养。通过控制气流和搅拌速度，并在必要时充以纯氧，使溶氧水平保持在空气饱和度的20％～30％。葡萄糖是唯一的碳源和能源。分别以常数和可变比生长速率补料策略进行分批发酵，在36和20h之后获得的终细胞密度分别达到了～100g干细胞重/L。后者得到的重组hIFN-g 的最终比收率和总产量分别为0.35g/g干细胞重和0.9g/(L·h)-1。采用新的阴离子和阳离子交换色谱纯化程序，从包涵体出发纯化hIFN-γ。rHu-IFN-γ的总回收率在～30％(100mg/g干细胞重)。用HPLC检测rHu-IFN-γ的纯度，并进行无菌度、致热性和DNA含量测试，以确保终产品中无有毒性物质和E. coli 的其它组分。通过病毒细胞病变效应分析，最终纯化的rHu-IFN-γ的抗病毒比活为2 × 107IU/mg 蛋白[6]。
五.干扰素前景展望
随着人们对干扰素研究的不断深入,尤其是现代分子生物学飞速发展,人们对干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理的不断阐明,使得人们在干扰素领域取得了空前的进步。特别是干扰素的聚乙二醇化(pegylated interferon) 和干扰素与载体脂质体(liposome2IFN) 的结合,很好的延长了干扰素在体内的代谢半衰期,增加了其稳定性,降低了其免疫原性,从而,扩大了干扰素的应用范围,同时也减少了刺激和毒副反应的发生[7] 。在未来的生活中,价格低廉而疗效好的基因工程干扰素将会在临床上得到广泛的应用。
参考文献
[1]刘运龙、程远国、刘学龙,干扰素研究进展动物医学进展,2008 ,29 (2) :85289
[2]楼士林、杨胜昌、龙敏男、章军等,基因工程,科学出版社,401页
[3]郑永霞、凌善峰,我国基因工程干扰素的研究概况,聊城大学学报自然科学版,2003 -3
[4]侯云德,干扰素研究的意义,中华实验和临床病毒学杂志,2005年9月第19卷第3期
[5]刘凡实、姜崴、隋宝真、张春丽,重组人干扰素α2b 的提取和纯化,微生物学免疫学进展,2004年第32卷第1期
[6]Khalilzadeh R等,J Ind Microbiol Biotechnol, 2004, 31(2): 63
[7]戚楠、马清钧,长效重组蛋白药物的研究进展,中国生物工程杂志,2006 ,26 (2) :79282.
