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多肽抗生素研究进展

   日期:2009-10-23     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1457    评论:0    
  

多肽抗生素是指相对分子质量通常在 1 ×104以下 ,具有抗菌活性的多肽类物质 。但是由于区分小肽与蛋白质的界限不很严格 ,不同学者对多肽抗 生素的分子量上限有不同的观点 。最初 ,人们把这类具 有 抗 菌 活 性 的 多 肽 称 为“antibacterial  pep2tides”,中文译为“抗菌肽”,其原意应为“抗细菌肽”后来发现有些“抗细菌肽”还具有抗真菌等其它微生
物的功能 , 便称之为“antimicro bial pep tides”。但是 随着研究的深入 ,人们相继发现这类多肽还具有抗 寄生虫 、病毒 、癌细胞等功能 ,尤其是随着这类多肽 物质在医药学上的应用 , 许多学者倾向于称之为 “pep tide antibiotics”———“多肽抗生素”。也许是由于几乎所有的多肽抗生素都具有抗细菌的功能“,  抗菌肽”作为一个约定俗成的名称 ,在国内依然被广泛采用 。如果没有特殊说明 ,本文中的多肽抗生素特 指由基因编码 ,在核糖体上合成的多肽抗生素 。那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质的抗生素 ,如杆菌肽 、多粘菌素 E 、短杆菌肽 S 等不在本 文的讨论范围之内 。

多肽抗生素研究的真正兴起是从 20世纪 80 年代初开始的 。1980 年 ,Bo man 等人从美国天蚕蛹中 分离得到了具有抗菌活性的多肽 ———cecropins , 并 于次年在《Nat ure》上公布了其氨基酸序列 。同是在1980 年 ,L ef ur 等人从兔的巨噬细胞中分离到了另 一种多肽抗生素 ———defensins , 并于 3 年后公布了其氨基酸序列 。此后数年间 , 人们相继从细菌 、真 菌 ,到两栖类 、昆虫 、高等植物 、哺乳动物 、直至人类 体内 ,发现了多肽抗生素 。目前 ,仅昆虫来源的多肽 抗生素 ,就已达 170 余种 。为了研究的方便 ,人们根 据多肽抗生素的结构对它们进行了分类 。
1  多肽抗生素的分类
1 . 1  具有螺旋结构的线性多肽  cecropins 是第一 个被发现的动物多肽抗生素 , 1980 年 , 由 Bo man 等1    从美国天蚕蛹中分离得到 。该类多肽抗生素 一般含有 37~39 个氨基酸残基 ,不含半胱氨酸 ,其 N 端区域具有强碱性 ,可形成近乎完美的双亲螺旋 结构 ,而在 C 端区域可形成疏水螺旋 , 两者之间有 甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区 ,多数多肽的 C 端被 酰胺化 ,酰胺化对其抗菌活性具有重要作用 。此后 , 人们相继从家蚕 、柞蚕 、果蝇 、麻蝇中分离到了 ce2 cropins 类多肽抗生素 。1989 年 ,L ee 等人从猪小肠 中分离到了 cecropin P1 ,说明了 cecropins 可能在动 物中广泛存在 。cecropins 对革兰阳性菌 、阴性菌都具有很强的杀伤力 ,而对真菌和真核细胞没有毒性 。 目前 cecropins 已被人工合成并已商品化 。magainins 也是较早发现的一类具有双亲螺旋
结构的多肽抗生素 。最初是从蟾蜍的皮肤中分离得 到的2     ,后来在哺乳动物的神经组织和肠组织中发 现了其类似物 。magainins 对革兰阴性菌 、阳性菌 、 真菌 、原生动物都有杀伤作用 ,但是对革兰阴性菌的 活性比 cecropins 要低 10 倍左右 。
此外 ,从一些动物的再生性器官和两栖类的多 种组织器官中分离得到了一些具有螺旋结构的多 肽 ,如来源于南美蛙的 der masep tin 和来源于树蛙的 bo mbininh 。
1 . 2  富含某种氨基酸的线性多肽  apidaecins 是从蜜蜂中分离得到的富含脯氨酸的多肽抗生素3 ,一 般含有 16~18 个氨基酸残基 ,其中脯氨酸含量高达
33 % ,精氨酸含量可达 17 % 。其一级结构中具有 PR P 和 P P 的典型 motif s 。apidaecins 对某些革兰阴 性菌具有很强的活性 , 而对革兰阳性菌不起作用 。apidaecins 对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌 科的致病菌的高杀伤力 ,使其在植物抗细菌病基因 工程和食品工业中有着很好的应用前景 。dro socin 是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的多 肽抗生素4     ,在结构上与 apidaecin 具有一定的相似性 ,但是在其 11 位的苏氨酸羟基上连接着一个 O2二糖链 (2 N2乙酰半乳糖胺2半乳糖) 。
coleop tericin 和 hemip tericin 分别来源于鞘翅目 和半翅目昆虫 ,一级结构中富含甘氨酸 ,分子量一般 较大 。Oppenheim 等人从人的腮腺和下颌腺分泌物中分离得到了一组富含组氨酸的多肽抗生素 ,长度 在 7~38 个氨基酸残基不等 , 被称为 histatins 。对 于引起口腔感染的多种微生物具有活性 。indoli2 cidin 是来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素 ,因其 13 个氨基酸中含有 5 个色氨酸而得名 。其 C 端是酰胺化的 。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很强 的杀菌活性 。
1 . 3  含有一个二硫键的多肽  这是一类数量很少 的多 肽 抗 生 素 , 第 1  个 被 发 现 的 这 类 多 肽 是 bactenecin ,来源于牛中性粒细胞5     。其 12 个氨基 酸中含有 4 个精氨酸 ,在其第 2 位和第 11 位氨基酸 残基间形成二硫键 。bactenecin 对大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌都有活性 。
这类多肽中还包括一些来源于蛙类皮肤的多肽 抗生素 ,一般在 C 端有一个由 7 个氨基酸形成的 “loop ”和 一 个 长 的 N  端“尾 巴 ”, 如 brevinin21 , brevinin22 。
1 . 4  含有两个或两个以上二硫键的多肽  这类多 肽的典型代表是 defensins , 最初发现的α2defensins 来源于哺乳动物的组织中6     ,一般含有 29~34 个氨 基酸残基 ,其中 6 个保守的半胱氨酸形成 3 个分子内二硫键 , 此外 , 其第 6 位和第 15 位的精氨酸 , 第24 位的甘氨酸也是保守的 。α2defensins 可形成 3 层 的β片层结构 ,通过 3 个二硫键和 Arg26 与 Glu224之间的盐桥而被稳定 。目前 , defensins 已被合成并已商品化 。defensins 对多种细菌和某些真菌具有杀 伤作用 , 并且对真核细胞有一定的毒性 。defensins 对革兰阳性菌的活性比革兰阴性菌强 。defensins 的 活性比 cecropins 弱 ,并且通常在低离子强度下起作 用 。
β2defensins 比α2defensins 大一些 , 一般含有 38~42 个氨基酸残基 。都含有 3 个二硫键和 4~8 个 精氨酸 。
昆虫 defensins 在 C 末端与α2defensins 相似 ,但是只有两个β片层结构 ,中间有一段α螺旋起稳定 作用 。主要对革兰阳性菌起作用 ,而对真菌没有作 用 。
植物 defensins 一般有 45 ~54 个氨基酸残基 ,可形成 4 个二硫键 ,3 个β片层结构和一个α螺旋结 构 。植物 defensins 一般只对真菌起作用而对细菌没有作用 。不同植物 defensins 对真菌的抗菌谱不 同 。
t hio nins 也是一类来源于植物的多肽抗生素 ,含 有 45~47 个氨基酸残基 ,有 6 个或 8 个半胱氨酸形 成的 3 个或 4 个二硫键 。其二级结构可形成 2 个反平行的α螺旋结构和 2 个反平行的β片层结构 。 t hio nins 抑制多种植物致病细菌和真菌 ,但是对假单 孢菌属和欧文氏菌属的细菌不起作用 。
1 . 5  羊毛硫抗生素  羊毛硫抗生素 (lantibiotics) 是 指一些由细菌产生的 , 由基因编码 , 在核糖体中合成 ,经翻译后加工而含有一些特殊有机基团的多肽 抗生素 。其中研究最广泛的是 nisin 。它是来源于 乳酸菌的一种多肽抗生素 ,成熟多肽由 34 个氨基酸 组成 ,含有羊毛硫氨酸 、甲基羊毛硫氨酸等特殊基 团 。主要对革兰阳性菌起作用 ,而对革兰阴性菌不 起作用 。已被广泛应用作食品保鲜剂7     。nisin 及 其类似物在医药上的应用研究也正在进行 。
2  多肽抗生素的生物学活性
2 . 1  多肽抗生素对细菌的杀伤作用  大多数多肽 抗生素都具有抗细菌的作用 。目前认为 cecropins 、magainins 、defensins 等许多可形成双亲螺旋结构的 多肽抗生素是通过作用于细菌的细胞膜 ,在膜上形 成离子通道 , 引起胞内物质的外漏而杀死细菌的 。 通过对 sarcoto xin IA 的研究发现 , 当在脂质体中存 在胆固醇时 ,sarcoto xin IA 对其的裂解作用减弱 。这可部分解释这类多肽对真核细胞不起作用的原 因8     。
apidaecins 类多肽抗生素对细菌的作用机制是 非裂解机制 ,可能是通过与膜上的手性分子相互作 用进而杀死细菌的 。
2 . 2  多肽抗生素对真菌的杀伤作用  许多多肽抗 生素除了具有抗细菌的活性外 ,还具有抗真菌的作 用 。如来源于蛙类的 P GQ ,der masep tin 和哺乳动物 的 defensins 对一些人类致病真菌具有杀伤作用 ,其 中兔 defensinN P21 对玉米的致病真菌也有作用 。一些来 源 于 植 物 的 多 肽 抗 生 素 , 如 植 物 defensins 、 t hio nins 等对多种植物致病真菌具有杀伤作用 。最 近 ,Cavallarin 等9    发现 cecropin 衍生物 N 末端α螺 旋区域的 11 个氨基酸顺序与抗真菌活力有关 。
2 . 3  多肽抗生素对原虫的作用  一些多肽抗生素可以有效地杀灭寄生于人类或动物的寄生虫 。如 Shiva2I (一种 cecropin 的类似物) 可以杀死疟原虫 ; 一种 cecropin/ melit tin 的杂合肽可以杀伤莱什曼鞭 毛虫 。
2 . 4  多肽抗生素对病毒的作用  目前发现多肽抗生素可以 3 种不同的机制起到抗病毒的作用10     。 第 1 种是通过多肽抗生素直接与病毒粒子相结合而 发挥作用 。如α2defensins , mo delin21 等对疱疹病毒 的作用 ,polyp hemusins 对 H IV 病毒的作用 。第 2 种 是抑制病毒的繁殖 ,如 mellitin 和 cecropin A 对 H IV 病毒的作用 。第 3 种机制是通过模仿病毒的侵染过 程而起作用 。如 melitit n 及其类似物 K7 I 的结构与 烟草花叶病毒核衣壳与 mRNA 相互作用的区域具 有相似性 ,通过干扰病毒的组装而对病毒产生作用 。
2 . 5  多肽抗生素对癌细胞的作用  许多研究显示与正常细胞相比肿瘤细胞对多肽抗生素更敏感 ,目 前对引起这种差别的原因还不完全清楚 ,初步认为 与以下几个因素有关10     : ①由于肿瘤细胞的高代谢 引起细胞膜电位的改变 ; ②肿瘤细胞膜外表面含有 更高的酸性磷脂 ; ③肿瘤细胞的细胞骨架或胞外基 质的变化 。目前已经发现 cecropin 及其类似物 , ma2 gainin2   及 其 类 似 物 , cecropinA2magainin2 ,   ce2 cropinA2melit tin 杂合肽及其类似物都对肿瘤细胞具 有选择性杀伤作用 。
3  多肽抗生素的合成
3 . 1  化学合成法  为了研究多肽抗生素的作用机 制 ,许多天然多肽抗生素及其类似物已通过固相合 成的方法得到 。其中研究最多的是具有双亲螺旋结 构的带正电荷的多肽 。通过改变或增删多肽某些位 置的氨基酸 ,可以研究多肽抗生素一级结构的保守性 。在研究该类多肽抗生素与细菌细胞膜的相互作 用时 ,利用 D2型氨基酸合成了天然多肽的对映体 。 天然多肽形成左手螺旋 ,而其对映体形成右手螺旋 , 发现 D2型氨基酸形成的对映体与天然多肽具有相 同的生物活性 ,从而进一步证明了双亲螺旋结构在
该类多肽的生物活性中具有重要作用 。为了寻找具 有更高抗菌活性或更广抗菌谱的多肽抗生素 ,一些 杂合肽相继被合成 。例如 ,由ecropin 和 melitit n 的 前 13 个氨基酸组成的杂合肽 CN ( 1 ~13 ) MN ( 1 ~13) 具有很强的抗菌活性而无溶血活性11     。为了节约成本 ,人们也在试图寻找更短的具有抗菌活性的 小肽 。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多 肽的一级结构 ,加入特殊氨基酸 ,对多肽末端进行修 饰 ,但是昂贵的成本是限制该方法工业化应用的最 大障碍 。
3 . 2  基因工程合成法  利用基因工程的方法生产 多肽抗生素是降低生产成本的一条有效途径 。但是 多肽抗生素对原核细胞的毒性在一定程度上限制了 其在原核表达系统中的应用 。而真核表达系统的较 低表达效率也是其工业化生产的一个障碍 。为了克服多肽抗生素对细菌细胞的毒性 ,人们采用融合表 达或选择对多肽抗生素具有抗性的株系进行原核表 达 。最早 J aynes 于 1989 年在大肠杆菌中融合表达 了 Shiva2I 基因 。1993 年 , Piers 等12     将 defensin , HN P21 ,cecropin/ melit tin 杂合肽基因分别与 4 个不
同的载体蛋白相融合 , 并在大肠杆菌中进行表达 。 对表达产物的产量 、细胞定位 、蛋白降解情况进行了 较为系统的研究 。对其中的一些融合蛋白进行化学 裂解或酶解后 ,得到了具有抗菌活性的小肽 。
1993 年 ,Maeno 等13    利用链霉菌表达系统分泌表达了 apidaecin 的融合蛋白 ,裂解后得到了有活性的产物 。1992 年 Reichhart 等14    在酵母中成功 表达了具有正确二硫键配对的绿蝇 defensin A ,产量 最高可达每 ml 培养基 215 μg 。1991 年 ,Anderso ns 等15    利用多角体病毒表达系统在昆虫细胞系中表达了 cecropinA 的融合蛋白 , C 末端未见酰胺化 ,后 来利用活体昆虫进行表达 ,产量提高了 60 倍 ,并且 部分产物被酰胺化 。在国内 ,谢维等16    在大肠杆菌 中表达了家蚕多肽抗生素 CM IV 。1999 年 ,沈俊卿 等17    在酵母中表达了 cecropin 的类似物 。

 

4  多肽抗生素的应用及前景
4 . 1  多肽抗生素在医药工业中的应用及前景
  目 前 ,所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病 株系 ,致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着
人们的健康 。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径 。多肽抗生素因为抗菌活性 高 ,抗菌谱广 ,种类多 ,可供选择的范围广 ,靶菌株不 易产生抗性突变等原因 ,而被认为将会在医药工业 上有着广阔的应用前景18     。目前 ,已有多种多肽抗 生素正在进行临床前的可行性研究 ,其中 magainins 已经进入三期临床试验阶段 。一些多肽抗生素在医 药研究中的进展情况见 Table 1 。
  现在大多数临床试验是用于局部治疗 ,这种治 疗应该是安全和有效的 ,因为一些毒性更强的多肽 和脂多肽 ,如短杆菌肽 S ,多粘菌素 B 已被用于制造 皮肤软膏 。这些多肽也可用于那些常规抗生素和常规疗法无效的地方 。利用粉剂的方法治疗肺部感染 是一个很有前途的发展方向 。口服药物可能会被用 于治疗肠道感染 ,nisin 正在进行抗螺旋杆菌的临床 试验 。至少有两个公司正在开发非肠道给药的治疗要解决以下问题 : 多肽抗生素的毒性 、稳定性 、免疫原性 、应用方法 、药物配方 。药物配方是影响治疗效 果的一个主要问题 。此外 ,体内蛋白酶 ,尤其是胰蛋白酶对多肽的降解 ,不同组织器官对多肽的吸收情 况都有待于进一步的研究 。
4 . 2  多肽抗生素在其他方面的应用及前景  由于 某些多肽抗生素对一些植物致病细菌和真菌具有很 强的抗性 ,一些多肽抗生素已经被用于植物抗病基 因工程19     。如 J aynes 等将两个 cecropin 的类似物基因 , Shiva2I 基因和 SB237 基因转入烟草 , 发 现Shiva2I 的转基因烟草对青枯病具有一定的抗性 ,而 SB237 的转基因烟草没有抗性 。Huang 等的研究表 明将 cecropin 类多肽 MB239 基因与大麦α淀粉酶信 号肽基因融合后转入烟草中 ,所得植株对野火病的抗性增强 。在国内 , 黄大年等20    利用 cecropinB 基 因转化水稻 ,得到了一些对水稻细条病具有不同抗 性的植株 。
多肽抗生素动物转基因的研究也已经取得了一 些进展 ,比如可以通过基因工程的方法来阻断一些 虫媒疾病的传播 , Po ssani 等21    的研究表明 ,在蚊子 体内表达 Shiva23 可以抑制疟疾的传播 ,但是在蚊子 的转 基 因 技 术 方 面 还 存 在 着 一 些 困 难 ; Durasula 等22    通过在长红猎蝽的共生菌中表达 CecropinA 明显减少了其体内锥虫的数量 。Reed 等23    将 Shi2 va2Ia 转入小鼠中 ,转基因小鼠对布鲁氏杆菌的抵抗 力显著增强 ,这为人工培育抗病饲养动物新品种提 供了新思路23 
   。此外 ,多肽抗生素在食品防腐 ,鲜 花保鲜和动物饲料添加剂等方面的应用研究也正在 进展之中 。
参考文献
 

 
     
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