超临界流体是指物质在温度、压力高于临界温度和临界压力时所形成的可压缩性高密度流体,其密度接近液体,黏度接近气体,具有与液体相近的溶解能力和与气体相近的扩散特性。超临界流体最显著的性质是其密度随温度和压力的改变而改变,因而可以通过调节温度或压力达到改变其溶解能力的目的。常见的超临界流体介质有二氧化碳、乙烯、乙烷、水等。超临界流体技术从最初的单纯萃取扩展到有机合成、化学分析和环境保护等多个领域,而且与化学、生物学等学科交叉发展。作者对生物工程领域目前研究比较热门的超临界流体酶催化、超临界流体发酵、超临界流体灭菌和细胞破碎技术作以概述。
1 超临界流体酶
催化酶的本质是蛋白质,作为一种高效生物催化剂,酶能在温和条件(常温常压)下催化化学反应,具有高效性、区域选择性和立体专一性。传统的酶催化反应是在水溶液中进行的。20世纪70年代末,以含微量水的有机溶剂作为反应介质的酶促反应取得突破性进展,常见的有机溶剂为正己烷等。较水而言,有机溶剂中可催化的底物范围得到了扩展,可以进行水不溶性物质的催化反应,反应后酶由于不溶于有机溶剂,回收便利,溶剂与溶质分离能耗降低,酶在有机溶剂中的热稳定性也有所提高。不过有机溶剂的缺点是多为有毒物质、易燃易爆、不安全、价格贵,且存在溶剂残留问题。随着绿色化学概念的兴起,寻找一种无污染的廉价物质来代替有机溶剂已提上了日程。1985年Ｈａｍｍａｒｄ率先提出超临界二氧化碳(ＳＣＣＯ2)可作为酶催化酯交换反应的介质[1],接着Ｎａｋａ ｍｕｒａ报道了ＳＣＣＯ2下碱性磷酸酶与脂肪酶催化甘油三酯酯交换反应的研究结果[2],随后十几年来,国外已对十多种酶及其在ＳＣＣＯ2中的反应进行了研究。研究的酶多集中于脂肪酶类,如毛酶脂肪酶、圆柱形假丝酵母脂肪酶和无根根酶脂肪酶等,研究的反应也多是与油脂工业中油脂改性和多不饱和脂肪酸富集有关的反应,包括酯化、氧化、酯水解等。一些酶催化反应的报道见表1。
超临界流体酶催化中酶的稳定性和活性是反应的关键因素。酶在水溶液中时,其活性主要受温度和ｐＨ值影响;在超临界流体中时,由于流体的可压缩性和极性可变的特点,影响酶活性的因素增多,包括了压强、温度、流体种类、含水量等。其中含水量是一个关键因素,酶在有水存在时才有催化活性,一般而言,含质量分数为5%～10%水的固定化酶在ＳＣＣＯ2中具有稳定的活性[3,4],含质量分数为50%或更多水时活性就会明显降低[2,3,5],可能的原因是过多水阻碍了脂溶性底物与酶分子的结合,以及降压时酶分子结合水中溶解的ＣＯ2迅速解吸导致酶蛋白结构变化而失活[6]。压力对酶活本身没有影响[7],但影响流体密度,进而改变流体的溶解能力,使底物浓度发生改变,影响酶的表观活性。当含水量大时,压力的改变还会引起ＣＯ2解吸而影响酶蛋白结构,使酶活性降低。温度对酶活性的影响类似于水溶液中的情况,过高的温度使酶变性失活,同时温度对底物的溶解度也有一定影响。流体种类对于酶活影响有不同的报道,多数研究结果表明超临界流体较水与有机溶剂更利于酶催化反应,如ＳＣＣＯ2中乙酸乙酯与戊醇的反应速度是己烷中的2～4倍[8];ＳＣＣＯ2中胆甾醇的氧化反应速度比水溶液中快75倍[9]。但也有相反结果的报道,如以正己烷和超临界二氧化碳、乙烯、乙烷、三氟甲烷、六氟化硫等为溶剂研究甲基丙烯酸甲酯的醇解反应时,发现[10]ＳＣＣＯ2的初始反应速度比正己烷慢得多(反应速度最快的是六氟化硫,比正己烷高一个数量级),其解释可能为溶解于结合水中的ＣＯ2酸化了酶的环境而使其活性降低[7]。不过即使在ＳＣＣＯ2中的反应速率不及正己烷,其便利的反应分离一体化操作及无溶剂残留的特点也使其具有很大的优势。
提高酶稳定性的方法之一是固定化。酶的固定化技术包括吸附法、交联法、共价法、包埋法等,此外还有分子沉积法和酶晶体交联法等新技术。固定化的载体常见的有硅藻土、氧化铝、硅胶、多孔玻璃、ＤＥＡＥＳｅｐＨａｄｅｘ、离子交换树脂等,如常见的Ｎｏｖｏ公司的Ｌｉｐｏｚｙｍｅ系列酶就是把来源于微生物Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ的脂肪酶以吸附法固定于离子交换树脂上的一种应用较广的商品酶。
2 超临界流体发酵
应用超临界流体作为整体细胞反应介质的技术晚于超临界酶催化技术,至今只有十多年的历史,人们发现许多化学反应不是由单一的酶催化,而是由许多酶组成的多媒体系共同催化,同时多媒体系的催化效率与其所处的相对位置也有一定关系,另一种情况是催化反应需要一些辅酶的参与,因此应用完整细胞发酵,结合强渗透性的超临界流体作为发酵介质成为一种可行的方案。这项技术目前多见于乙醇的发酵提取中。
常规的乙醇发酵过程有两个问题需要解决:一是发酵产物乙醇对发酵过程的阻抑,二是发酵反应放热引起的阻抑。目前使用的发酵菌株耐醇性较差,所以只能制得乙醇质量分数为8%～12%的稀溶液,解决办法是选育耐醇菌株,或者边发酵边提取乙醇,使乙醇质量分数始终维持在较低水平,具体方法有:真空发酵、溶剂萃取发酵、使用疏水性分子筛、使用膜生物反应器、使用超临界流体介质、加入蛋白质-磷脂复合体等。超临界流体拥有高渗透性和高扩散性,对乙醇有较大溶解度,可透过细胞膜把乙醇萃取出来,并及时排出,最大限度地控制乙醇对发酵反应的阻抑作用,同时采用ＳＣＣＯ2循环方式,可以及时带走发酵中产生的反应热,最大限度地减少反应热对微生物的不良影响。另外ＳＣＣＯ2对于乙醇的浓缩也有很大帮助,一般发酵液的乙醇质量分数为8%～12%,须浓缩到95%方可商品化,若作燃料,按标准应浓缩至99 5%,传统的浓缩方法是精馏法,其耗能高,且当乙醇质量分数达到95 6%时形成醇水共沸物而无法继续精馏,若再改换苯系精馏,则操作难度和生产费用进一步增加;而以ＳＣＣＯ2发酵法制取乙醇可大幅降低能耗(约为传统精馏法的1/6),产品中乙醇和ＣＯ2的沸点差异很大,因而分离效果极好。文献[21]以固定床微生物发酵结合ＳＣＣＯ2逆流提取技术,可制得质量分数为99%以上的乙醇。
超临界流体发酵的主要问题是在高压及高渗环境下,细胞的生理活性和发酵能力会受到很大影响。有报道指出,压力本身对细胞的影响不大[22],操作时的升降压速率是影响细胞存活率的关键因素,升降压速率越快,细胞存活率越低,处理时间越长,存活率越低,在35℃、14ＭＰａ时,升降压时间为1ｍｉｎ,以ＳＣＣＯ2处理酵母细胞9ｍｉｎ,存活率为36%,处理37ｍｉｎ,存活率降至1/10000[23],当升降压时间缩短到几秒后,处理2ｍｉｎ,酵母细胞的存活率就下降至24%[24]。不同的介质对细胞的抑制程度不同,如当ＣＯ2压力为0 2736ＭＰａ时酵母细胞Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的生长速度为零,而在同条件Ｎ2中无此现象发生[22]。ＣＯ2对许多微生物有抑制作用,可能的原因是ＣＯ2扩散入细胞内形成ＨＣＯ-3离子,导致细胞内ＨＣＯ-3增多,ｐＨ降低,引起酶活性的改变,另外ＨＣＯ-3也可能改变细胞膜的离子强度与介电常数,影响膜的流动性和功能[23]。
超临界流体拥有优良的溶剂性能以及无毒、低能耗、易分离的特点,如能解决好细胞在超临界流体中的活性问题,以及发酵与产物分离一体化问题,将使超临界流体发酵技术得到更快的发展。
3 灭菌和酶灭活
食品和制药工业中经常需要灭菌或酶灭活,以防微生物污染或分解产品,同时防止酶对产品的分解破坏。其常见的方法有:过热蒸汽法、微波法、紫外线和γ射线法及加热法,其中除射线法外,其他方法均会因高温对热敏性生物物质产生破坏。以超临界流体处理,可以在比较温和的条件下杀灭微生物和酶,避免因高温消毒引起产品的破坏。ＳＣＣＯ2是各种超临界流体中最具灭菌效果的介质,其灭菌机理为:ａ 抽提出微生物细胞内或细胞膜的功能性物质,破坏细胞膜的完整性;ｂ 进入微生物细胞内的ＣＯ2形成ＨＣＯ-3离子,使细胞质的酸性增加,ｐＨ下降,抑制胞内酶的活性;ｃ 急速减压时细胞内ＣＯ2体积迅速膨胀而使细胞破裂。ＣＯ2酶灭活的机理为:ａ 酸化酶的微水环境,抑制酶的活性;ｂ 减压时,溶于酶分子结合水中的ＣＯ2迅速逸出,使酶分子结构变形破坏。
据报道,在35℃、6ＭＰａ的ＳＣＣＯ2中连续处理样液15ｍｉｎ,样液流量为20ｋｇ·ｈ-1,出口瞬间减压,当ＣＯ2流量为0 5ｋｇ·ｈ-1时,可全部杀灭乳酸菌,当ＣＯ2流量增加到1 0ｋｇ·ｈ-1以上时,大肠杆菌和酵母菌被全部杀灭[25]。在35℃、10 13ＭＰａ的ＳＦＣＯ2中静态处理含大肠杆菌和发面酵母的样品2ｈ,湿细胞(含水ｗ=65%～75%)灭菌率分别为0 006%、0 012%,干细胞(含水ｗ=5%～15%)灭菌率分别为12%、65%[26],可见在超临界环境中含水量对微生物存活率影响很大。在酶灭活方面,40℃、20ＭＰａ、30ｍｉｎ的ＳＣＣＯ2处理可使小麦胚芽中的脂肪氧化酶全部失活[27]。60℃、13 7ＭＰａ、25ｍｉｎ的ＳＣＣＯ2处理可使桔汁中的果胶酶全部失活[28]。
4 细胞破碎
传统的细胞破碎技术有:高压匀浆法、高速球磨法、超声波法、酶法、化学法和渗透压法等,但各种方法均存在一定缺点,如高压匀浆法、高速球磨法、超声波法在操作中会产生大量的热,对一些生物活性物质产生破坏;酶法(如加入纤溶酶)、化学法(如酸热法)和渗透压法会不可避免地引入杂质,其处理能力也偏小。超临界流体细胞破碎技术可以较好地解决上述问题。高压ＣＯ2易于渗透到细胞内,突然降压使细胞内外压差急剧增大而膨胀破裂,对于细胞壁较厚的微生物,因ＣＯ2能破坏胞壁上的脂溶性成分,降压时破裂发生在一定位置,使破碎后的细胞碎片较大,便于下游分离,同时在降压过程中流体体积膨胀,温度降低,可防止因升温引起生物活性物质失活。如以超临界一氧化二氮处理酿酒酵母细胞(68ｇ·Ｌ-1),35ＭＰａ、40℃、25ｍｉｎ蛋白释放率可达27%,核酸释放率达67%;对于大肠杆菌(69ｇ·Ｌ-1),蛋白释放率达17%,核酸释放率达51%;对于枯草芽孢杆菌(93ｇ·Ｌ-1),核酸释放率达21%[29]。
5 结束语
超临界流体技术在生物工程领域的应用大有潜力,由于超临界流体的特殊性质,选择合适的超临界流体能使操作在较低温度下进行,可以保护热敏性物质;其无氧的惰性环境可避免产物的氧化;产品中无溶剂残留;通过改变操作温度或压力就可以完成产物的提取和分离;分离后的流体经压缩即可循环利用,可以大大降低回收溶剂的能耗。
超临界流体在工业生产中优势显著,但其不足之处是超临界设备一次性投资较高,在高压条件下难以实现连续化投料,而且目前有关高压下的物质属性及相平衡数据相对缺乏,许多实验数据难以得到理论解释,这在某种程度上限制了超临界流体技术的发展。相信随着超临界流体理论的逐步完善和设备制造工艺水平的不断提高,超临界流体技术在生物工程领域势必得到更为广泛的应用和发展。
