赖氨酸(lysine)的化学名称为2, 6一二氨基己
酸，分子式为C6H14N2O2[1]。有L一型(左旋),D一型
(右旋)和DL一型(消旋)3种旋光异构体，然而可供
人类和动物吸收利用的只有L一型[2] L一赖氨酸为
人类和动物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，
被广泛用于饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等
方面，其中90%以上的赖氨酸产品用作饲料添加
剂一’一。研究表明，向谷物饲料中添加适量的L一赖
氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生
长。L一赖氨酸能够决定断奶仔猪体内蛋白质合成
与沉积以及其他氨基酸的利用率，L一赖氨酸转化为体蛋白的效率高达86%[4]我国对赖氨酸的需求
量位于全球各国的前列。
近20多年来，由于赖氨酸的市场需求迅速增
长，从而拉动了L一赖氨酸的生产，使产量有了飞速
发展，尤其是2003年以后，我国已成为全球最大的
赖氨酸生产国[5]。目前，国内外赖氨酸生产均采用
发酵法，常规育种技术使谷氨酸产生菌选育的菌种
产酸率约为13%一17%，发酵周期为60一64 h;而
用基因工程技术从大肠杆菌改造所得的菌种产酸
率为16%一19%，发酵周期为40一50 h[6-7]。
国外赖氨酸生产厂家主要有日本味之素、韩国希杰、美国ADM和德国Degussa等，国内主要生产
厂家有吉林大成、中粮生化、山东金玉米、宁夏伊品
和东方希望等尽管我国赖氨酸产量已稳居世界
第一，但赖氨酸生产用的菌种和相关发酵技术基本
上被日本味之素、韩国希杰等垄断。所以，有必要
选育拥有自主知识产权的L一赖氨酸高产菌，并采用
先进的发酵工艺提高产酸率和糖酸转化率，使我国
的赖氨酸工业具有国际竞争力。
笔者从L一赖氨酸生产方法、生物合成途径、关
键酶活性调节作用以及L一赖氨酸产生菌的育种研
究现状等4个方面综述了微生物产L一赖氨酸的研
究现状及应用前景。
1赖氨酸生产方法
L一赖氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、
酶法和微生物发酵法4种，其中发酵法制备L一赖氨
酸是当前的主要生产方式〔8〕。
1. 1提取法
L一赖氨酸广泛存在于酪蛋白、纤维素蛋白和脱
脂大豆蛋白等蛋白质水解物中。提取法一般是以
动物血粉为原料，再从蛋白质水解物中，用离子交
换法或苦味酸沉淀法分离提取赖氨酸。1891年，
Fisher和Drechsel在干酪素酸水解液中首次发现并
获得L一赖氨酸晶体。此方法特点是工艺简单，但原
料来源有限，只适用于小规模生产一9一。
1. 2化学合成法
化学合成法一般是以化学物质为原料合成
L一赖氨酸。此方法工艺路线较多，所用的原料也有
所不同，工业上主要运用的是荷兰的DSM法和日本
的东丽法，使用的原料分别是己内酞胺和环己烯。
此法最大缺点是使用剧毒原料光气，导致产品安全
性差，并存在严重的环保问题一9一。
1. 3酶法
酶法是以己内酞胺或二氢吠喃为原料，借助于
有机合成与生物化学工程相结合的生产技术生产
L一赖氨酸。己内酞胺或二氢吠喃经化学方法生产
环己烯，再制得DL一氨基己内酞胺。其中D-氨基
己内酞胺经奥巴无色杆菌的消旋酶催化的消旋反
应生成L一赖氨酸，L-氨基己内酞胺经水解酶(源自
罗氏隐环酵母等菌)发生水解反应生成L一赖氨酸。
此方法中，酶自身稳定性差，易发生水解作用，产生
许多非必要的产物，因此产率较低一9一。
1. 4微生物发酵法
1960年日本的木下祝郎、中山清等经紫外诱变
获得一株谷氨酸棒杆菌营养缺陷型变异株，从此工业
上开始了发酵法生产L一赖氨酸[’。〕。微生物发酵法
存在两个途径:1)二氨基庚二酸途径即添加前体发酵
法，主要存在于细菌、绿藻、原生虫和高等植物中;2)
a一氨基己二酸途径即直接发酵法，主要存在于酵母、
霉菌中’‘一‘“。用于发酵法生产乙一赖氨酸的微生物
有谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、黄色短杆菌、酿酒酵
母、乳酸发酵短杆菌、假丝酵母、嗜乙酞乙酸棒杆菌和
嗜热产氨棒杆菌等’i一’“。微生物发酵法生产赖氨酸
通常以淀粉水解糖、甘蔗或甜菜制糖后的废糖蜜为原
料，原料来源广泛且价格便宜，同时微生物发酵法产
生的赖氨酸都是L一型(左旋)的，而生物所能利用的
赖氨酸一也只是L一型。因此，微生物发酵法是目前工
业生产L一赖氨酸最主要的方法。
2赖氨酸的生物合成途径
在微生物和植物中赖氨酸的合成具有两个完
全不同的路线:二氨基庚二酸途径和。一氨基已二
酸途径[a一〕
2.i二氨基庚二酸途径
二氨基庚二酸途径又称天冬氨酸途径，是从天
冬氨酸开始的通过二氨基庚二酸的代谢途径。细
菌、某些真菌、一些藻类和高等植物是通过该途径
生产赖氨酸。该途径又包括两个不同的代谢途径，
即唬拍酸途径和乙酚途径，只有在少数生物中如棒
状杆菌和浸麻芽胞杆菌属中这两个途径是可以共
存的。它们的共同点在于均受天冬氨酸激酶的反
馈抑制调节影响。
2. 2。一氨基己二酸途径
该途径是从酮戊二酸或乙酚一CoA开始的通过
a一氨基已二酸的途径，其中。一氨基已二酸途径多
发生在高等真菌(如酵母菌和霉菌)，古细菌以及细
菌中。该途径首先利用高异柠檬酸合成酶、高乌头
酸合酶/}I}}高乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶催化。一酮
戊二酸和乙酞一CoA生成。一氨基已二酸，再经过
a一氨基已二酸还原酶，酵母氨酸还原酶和酵母氨酸
脱氢酶催化生成赖氨酸一‘7〕。
3关键酶的活性调节
在微生物发酵生产L一赖氨酸途径中易受多种
酶的活性调节影响，主要有:丙酮酸脱氢酶系
(PDH动、丙酮酸梭化酶(PYC),磷酸烯醇式梭化酶
}PEPC}、天冬氨酸激酶OAK)、高丝氨酸脱氢酶
(HSDH)、二氢毗陡二梭酸合成酶(DHDPS)等。
3. 1丙酮酸脱氢酶系
丙酮酸脱氢酶系(PDHc)存在于微生物、哺乳
动物及高等植物中，由丙酮酸脱氢酶(PDC)、二氢
硫辛酸乙酞转移酶( DLAT)和二氢硫辛酸脱氢酶
(DLDH)3种不同的酶及TPP、硫辛酸、FAD,NAD'、
CoA和Mgz‘共G种辅助因子组成。在PDHc中最
重要的是第一种成分丙酮酸脱氢酶，该酶由aceE基
因编码‘g〕。PDH。能催化丙酮酸氧化脱梭产生乙
酚- CoA，同时可将NAD十还原为NADH，进人三梭
酸循环。E1,E2和E3以首尾相接的形式发挥催化
作用:’“:。丙酮酸脱氢酶是丙酮酸脱梭反应的限速
酶，其活性受到严格控制，是活性调控的一个靶位
点一‘”〕。在生物合成过程中，通过降低其表达，可以
提高菌株对糖的转化率
3. 2丙酮酸梭化酶
丙酮酸梭化酶(PYC)由P”基因编码，是一种
重要的生物素酶，也被认为是主要的添补酶，广泛
存在于哺乳动物、真菌、植物组织和细菌中[zn〕丙
酮酸梭化酶基因(Pyc)的删除导致在以乳酸为唯一
C源的条件下细菌无法生长，而过表达pyc基因或
引人Pyc基因，可大大提高赖氨酸的产率。
在细菌中，丙酮酸梭化酶可催化丙酮酸生成草
酚乙酸(OAA)，它和磷酸烯醇式丙酮酸梭化酶
(PEPC)一样，在对三梭酸循环中间产物草酚乙酸
(OAA)的补充上起着重要作用。在大肠杆菌
( Escherichia coli)等多数细菌中，只有PEPC参与
OAA的补充;而仅有少数细菌，如谷氨酸棒杆菌
( Corynebacterium glutamicum)中同时存在这两种
酶，但PYC对OAA生成的贡献高达90%以上u。
研究表明，不同来源的PYC蛋白，都具有高度保守
区域。在序列的N端，有一段所有的生物素酶类中
都存在的共同序列:GGCGRG(R可为K)，这一共
同序列被认为是ATP的结合位点:zz}。Kumar等23
认为，在序列的中部，存在另一个关键的区域:
FLFEDPWDK，该序列中间的色氨酸残基(W)参与
了转梭基反应中的丙酮酸结合过程。在序列的C
端，有一个被认为是生物素的结合位点的、非常保
守的部位:AMKM，其中的赖氨酸残基(K)与生物素
可特异性共价结合，并且C端另外3个特定位置的
甘氨酸残基也参与了生物素的结合一z‘一2，〕。
3. 3磷酸烯醇式梭化酶
磷酸烯醇式梭化酶(PEPC)由PP。基因编码，以
Mg-‘或Mnz‘为辅助因子，催化磷酸烯醇式丙酮酸
( PEP )和C0}生成草酞乙酸(OAA)和无机磷酸，从
而保证了TCA循环和氨基酸合成中Ca分子的持续
供应。1984年，首次从已克隆到的大肠杆菌PP。基
因推测出PEPC的一级结构，结果发现PEPC分子
由2个不同的区域构成，一个保守区域(C末端区)
和一个可变区域(N末端区)。所有已知的PEPC都
是四聚体，四个相同亚基的相对分子质量为9. 5 x
10a一11. 0 x l0a}z}}。大多数PEPC是变构酶，其活
性调控方式为变构作用，受到正代谢效应物(如
6一磷酸葡萄糖)和负代谢效应物(苹果酸和天冬氨
酸)的变构调控。大肠杆菌PEPC的调控方式更为
复杂，它的激活剂有乙酞一CoA,1,6一二磷酸果糖、
长链脂肪酸和3,5一二磷酸鸟昔，抑制剂有L一天冬
氨酸或L一苹果酸。此外，大肠杆菌的PEPC没有磷
酸化调控[z} }。在生物合成过程中，若增强PEPC活
性，提高PEPC/三梭酸循环酶活性的比率，则可提
高菌株的对糖转化率。
3. 4天冬氨酸激酶
天冬氨酸激酶( AK)由恤C基因编码，它是一
种催化L一天冬氨酸生成天冬氨酸磷酸的酶，并参与
氨基酸如赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的生
物合成[zs〕天冬氨酸激酶是天冬氨酸族氨基酸生
物合成途径中的关键酶，是L一赖氨酸生物合成过程
中第一个限速酶，是由2个A亚基和2个B亚基组
成双亚基或四亚基的变构酶( Az BZ )，其活性受该途
径末端产物的协同反馈抑制研究发现，a一亚基与
催化和调节功能有关;刀一亚基缺少催化能力，但对
由L一lys引起的抑制作用具有轻微的构象调节作
用;a一亚基复性过程中加入刀一亚基后其活性提高
了约30% }-9}。在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶
均有一个同工酶存在，赖氨酸和苏氨酸对该酶的生
物活性具有反馈抑制作用。在芽胞杆菌中，天冬氨
酸激酶存在2种不同的同工酶:一种同工酶受赖氨
酸和蛋氨酸的反馈抑制作用;另一种同工酶仅受苏
氨酸的反馈抑制作用。在育种技术中，以赖氨酸的
结构类似物S一(2一氨基乙基)一2‘一半胧氨酸(AEC)
为底物，筛选抗反馈调节的天冬氨酸激酶突变株，
可使赖氨酸得到积累〔3。一。
3. 5高丝氨酸脱氢酶
高丝氨酸脱氢酶( HSDH)由horn‘基因编码，可
催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。高丝氨酸是
赖氨酸生物合成途径中最重要的分支代谢产物，并
可最终生成蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸:3‘:。在微生
物发酵合成天冬氨酸族氨基酸的代谢过程中，高丝
氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶控制着整个发酵过程
中C源和N源的走向，是决定能否获得高产氨基酸
的关键酶。但HSDH不是赖氨酸生物合成中的限
速酶，受L一苏氨酸的反馈抑制作用的影响[32]。在
L一赖氨酸生物合成途径中，如果打断合成高丝氨酸
的代谢途径，使代谢流流向赖氨酸合成方向，可达
到增加赖氨酸产量的目的
3. 6二氢毗咤二梭酸合成酶
二氢毗陡二梭酸合成酶( DHDPS)由dh咖、基因
编码，催化天冬氨酸半醛生成二氢砒咤一2,6一二梭
酸。dh咖、基因在L一赖氨酸生物合成中充当管家基
因的角色，其表达模式和ak-hsdh基因的表达模式
类似〔33] } DHDPS是赖氨酸生物合成分枝途径中的
第一个酶，也是最主要的酶，控制着L一赖氨酸的产
量，广泛存在于细菌、澡状菌和高等植物中。大多
数DHDPS具有同源四聚体结构，每个单体由一个
( a招 )，折叠片和一个“C”末端a一螺旋区域组
成[34。在细菌(如E. coli)中，DHDPS被赖氨酸抑
制，但不受其阻遏;而在黄色短杆菌(如谷氨酸棒杆
菌)中，DHDI'S没有被末端产物赖氨酸所抑制。终
产物赖氨酸对DHDPS的反馈抑制作用并不能控制
dh咖、基因的表达，其主要作用是防止细胞器中赖
氨酸的积累[35一:。
4国内外L一赖氨酸菌种选育发展的
现状
国内外产L一赖氨酸菌种的选育技术包括诱变
技术、基因工程如DNA重组技术和基因敲除技术
等。利用基因工程方法进行选育是通过分子水平
上最小限度的、最明确的基因突变来优化菌株。
L一赖氨酸菌种选育的主要思路可以概括为以下几
点[,}_:L)添加结构类似物，筛选出抗结构类似物的
突变株，如添加L一赖氨酸结构类似物。S一(月一氨
基乙基)一L一半耽氨酸(AEC) ;2)改变生产菌细胞
膜通透性，调节细胞内代谢产物的积累;3)添加前
体物质，抑制分支代谢途径;4)对关键性酶的基因
进行定点突变，解除反馈抑制;5)切断或改变平行
途径，如通过基因敲除方法获得高丝氨酸脱氢酶缺
失菌株。主要方法有:诱变技术育种、基因重组技
术育种和基因敲除技术育种。
4. 1利用物理、化学诱变技术常规育种的现状
自1960年，经紫外诱变获得1株积累L一赖氨
酸的谷氨酸捧杆菌营养缺陷型变异株以来，采用诱
变育种技术提升赖氨酸生产效率获得了迅速发展，
并成为推动微生物发酵法制备L一赖氨酸的主要
技术。
Chaudhurl等!38〕以枯草芽胞杆菌为出发菌株，经
MNNG诱变处理，利用AEC平板进行抗反馈抑制天
冬氨酸激酶突变株的筛选，再利用紫外线进行复合诱
变，获得产酸达21扩L的突变株。范长胜等〔39〕以黄
色短杆菌FM84 -415为出发菌株，经亚硝基肌诱变获
得苏氨酸、高丝氨酸双重营养缺陷型，同时发现对
AEC和MT具有抗性的突变株，其产酸达64. 3粼L}
Gasent-Ramirez等〔40}以酿酒酵母为出发菌株，加人赖
氨酸结构类似物AEC，并以脯氨酸为唯一N源，筛选
获得的突变株产酸量是出发菌株的3. 7倍潘中明
等[’]〕以AL039为出发菌株，经亚硝基肌诱变，筛选到
1株氟丙酮酸敏感型突变株，产酸达40. 3留L。张伟
国等:6〕以黄色短杆菌ATCC14067为出发菌株，经亚
硝基肌、硫酸二乙醋逐级诱变处理，再用AEC,磺胺肌
等氨基酸结构类似物及唬拍酸为唯一C源，筛选到一
株产酸达77一82郭L的菌株。齐秀兰等〔}z〕以钝齿棒
杆菌D60一95为出发菌株，经紫外线诱变处理，获得
了抗七叶普的细胞膜通透性发生改变的突变株，其产
酸达82到L。张伟国等‘以黄色短杆菌XQ一8为出
发菌株，选育到L一赖氨酸高产菌XQ一89，摇瓶发酵
72 h赖氨酸产量达到77扩L;当乙酸、吐温一80和玉
米浆的添加量进行优化后赖氨酸达到94郭L，比优化
前提高了22. 1 % o
4. 2利用基因重组技术育种的现状
传统的诱变育种需要花费大量的人力和时间，
并且存在获得目标突变菌株的概率低等缺点，基因
重组技术育种方法越来越受人们重视。基因重组
技术又称遗传工程，是在体外重新组合DNA分子，
并使它们在适当的细胞中进行增殖表达的一种遗
传操作该技术不受亲缘关系限制，为遗传育种开
辟了崭新的途径。
谢玉清等:43〕将赖氨酸合成途径中2个关键酶
二氨基庚二酸合成酶dapA)和磷酸烯醇式丙酮酸
梭化酶(ppc)重组克隆到同一载体上，并转化到赖氨
酸产生菌黄色短杆菌中，通过基因表达提升了上述
2个酶的活力，使赖氨酸产量由原来的2%提高到
3. 5 %。王成华等f44:构建了重组的高丝氨酸缺陷型
谷氨酸棒杆菌，在高丝氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌中
强化表达二氨基庚二酸合成酶( dapA)基因，使重组
菌产酸量达8. 9岁L，是出发菌株的1. 4倍。Seibold
等:as;把链霉菌中的淀粉酶基因导人到谷氨酸棒杆
菌DM1730中，获得能够直接利用淀粉生长和产赖
氨酸的重组菌株，从而省略了淀粉原料的水解工
艺，降低了赖氨酸生产成本。董迅衍等4“〕克隆了来
自L一异亮氨酸生产菌(乳糖发酵短杆菌)天冬氨酸
激酶(AK一1)的编码基因(L?".sCl )，将LysCl重组到
野生型乳糖发酵短杆菌ATCC13869中，重组菌经诱
导表达LysCl，摇瓶发酵积}L一赖氨酸达7. 4 g/L,
在3L发酵罐上达40粼L
4. 3利用基因敲除技术育种现状
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点
整合人靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定
点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想
的修饰、改造生物遗传物质的方法。
Ohnishi等:4}〕将野生型菌株的天冬氨酸激酶的
第311位上的苏氨酸通过定点突变改为异亮氨酸，
从而使突变菌株产赖氨酸量比野生型菌株高。饶
志明等〔48以谷氨酸棒杆菌ATCC13030染色体为模
板，通过基因敲除方法获得1株高丝氨酸脱氢酶缺
陷的突变株，该突变株发酵60 h后，产量达
4. 7别L，是出发菌株的6. 7倍。Liu等:49:以E. coli
W3110为出发菌株，对其染色体上如C基因进行敲
除，获得的突变菌株产赖氨酸量明显高于出发菌
株。陆敏涛等〔sod以C. }ekinense PD一67为出发菌
株，对其染色体上Plc基因进行敲除，构建ppc基因
缺陷型突变株，摇瓶发酵发现突变株产赖氨酸量低
于出发菌株。
5展望
随着畜牧业、食品制造与加工业和医药工业的
快速发展，我国对L一赖氨酸的需求越来越大，已成
为世界上第二大L一赖氨酸需求国。我国微生物发
酵法产L一赖氨酸起步晚，发展历程较其他国家短，
且发酵产酸水平较低，生产成本较高。因此，不断
发掘、筛选新的菌种和改良现有菌种，大规模发酵
生产L一赖氨酸，具有广阔的市场空间和巨大的经济
效益。
