微生物具备生命现象的特性和共性,将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题,如生命起源与进化,物质运动的基本规律等,和实际应用问题,如新的微生物资源的开发利用,能源、粮食等的最理想的材料。 微生物在当代农业生产中正占据着越来越重要的地位。在以高
微生物具备生命现象的特性和共性,将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题,如生命起源与进化,物质运动的基本规律等,和实际应用问题,如新的微生物资源的开发利用,能源、粮食等的最理想的材料。
微生物在当代农业生产中正占据着越来越重要的地位。在以高产为唯一目的传统农业生产中过量使用化学农药,是造成当前农业生态环境日趋恶化以及农业生产效率低下的一个重要因素。目前,我国农业正进入一个从传统农业向高效优质和可持续发展的现代农业转变的新的历史时期,特别是进入WTO以后我国农业还面对日趋激烈的国际竞争,生物农药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战。生物农药系指含非人工合成、具有杀虫杀菌或抗病能力的的生物活性物质或生物制剂,包括生物杀虫剂,杀菌剂,农用抗生素,生态农药等。以微生物对植物病害进行生物防治可分为三种情况:一为直接利用活体微生物作为生物防治剂(BCAs);二是利用微生物及其代谢产物中的活性成分,称为生化杀菌剂(Biochemical Fungicides);三是以微生物代谢产物为先导,合成新的化学杀菌剂,称为半合成杀菌剂。其主要机制为竞争作用、拮抗作用、重寄生作用和诱导植物抗性,或两种以上机制的协同作用。生物农药具有简便、有效、对生态和环境安全等优点,能完全或部分替代化学农药。以苏云金杆菌制剂、农用抗生素和病毒杀虫剂为龙头产品的生物农药已广泛应用在农业生产中。苏云金杆菌商品制剂目前已达100多种,是世界上产量最大,应用最广的微生物杀虫剂,美国用以防治蔬菜害虫和玉米害虫的面积分别占总面积的80%和50%,销售额从80年代末的4千万美元上升到90年代的5亿多美元。采用基因工程技术构建药效稳定,防治面较广的BT工程菌剂,是当前生物农药发展的新趋势。
农用抗生素研究开发在美、日等国均已列入国家重点科研规划。在日本已相继开发出春日霉素、多氧霉素和有效霉素等产品,曾一度代替化学农药在农业生产上大面积应用。由阿维菌素B1衍生的伊维菌素在20世纪90年代世界畅销的10种动物用药中占首位。抗生素特别是抗菌素在我国的开发不仅历史悠久,而且水平处于世界先进行列,并在国际上首次克隆了长达150kb的烯类抗生素合成基因簇。70年代开发的抗菌素如井冈霉素经久不衰,至今仍是防治水稻纹枯病的当家品种,每年使用面积达1 3亿亩。昆虫杆状病毒是一类重要的、较早应用的昆虫病原微生物。迄今为止发现的昆虫病毒已超过1000多株,涉及11个目900多种昆虫,已有20多个国家对30多种病毒杀虫剂进行了登记、注册、生产和应用;细菌及真菌杀虫剂等新型生物农药在病虫害防治中也显示出良好的应用前景。进入21世纪的我国生物农药研究和应用将重点发展苏云金杆菌(Bt)杀虫制剂、农用抗生素和病毒杀虫剂等龙头产业,加强真菌杀虫剂和植物源农药等新型生物农药的技术创新,实现生物农药产业的跨越式发展。此外微生物增产技术、单细胞蛋白的生产、食用菌生产、生物能源等也都是农业上的应用重点。
人类自工业革命尤其是20世纪以来,由于过分破坏和掠夺大自然,生态环境已严重恶化。可以说,未来的世纪是人类向大自然偿还生态债的世纪,其中,微生物的作用至关重要。对中国来说,21 世纪的水处理任务极为艰巨,其任务是防止由于水资源水质恶化对国家的经济可持续发展产生瓶颈效应甚至水质灾害。传统的物化处理方法存在着很多不足,比如重金属离子和芳烃类难降解有机物的去除效果很差,甚至没法去。污泥量大、处理量受限、易产生二次污染和成本高等。废水的生物处理法,是利用微生物的代谢作用,使废水中呈溶解态、胶体态和悬浮态的有机污染物质转化为稳定无害的物质。此技术应用于污水处理有利于提高生物反应器内的微生物浓度,有利于反应后的固液分离,缩短处理时间。此外,极端微生物也以其特殊的生理机制及其分泌的极端酶正成为研究热点,随着今后研究的深入将进一步推动极端微生物在污水处理中的应用。而今后的一个重要的发展方向是构建基因工程菌处理污水,运用原生质体融合和基因工程技术创建高效工程菌,为污水处理开辟广阔的前景,但其安全性问题还需进一步完善。同时微生物絮凝剂技术、固定化技术、生物吸附法、电极生物膜法等处理方法也大大的提高了处理效率。
农药残留微生物降解技术是一种是针对农业生产过程中杀虫剂、杀菌剂、除草剂等化学农药不用不行、而大量的施用又会造成农产品以及农业生态环境中农药残留严重超标、农产品市场竞争力下降等严重情况而形成的新型原位生物修复技术,其克服了物理、化学处理修复难度大、成本高、并且还会有二次污染的缺陷,从生物技术的角度,利用微生物种类繁多、代谢类型极为丰富的生物多样性原理与特点,通过筛选高效农药残留降解菌株,并经现代化工业大规模发酵制成菌剂,通过酶促降解和非酶促作用两种作用方式,应用于农药残留,达到清除土壤、水体、农产品中有机污染物的目的。为获取降解农药的微生物菌株,可从现已收藏的菌种中筛选,亦可以从土壤、水体或污染环境中直接分离筛选或经富集培养获得。通常是从长期被某种药剂污染的土壤和污水中取样经富集培养,再经固体培养分离纯化得到所需菌株。已报道的降解农药的微生物有细菌、真菌、防线菌、藻类等,大多数来自土壤微生物类群。而细菌由于其生化上的多种适用能力以及容易诱发突变菌株从而占了主要的位置,其中假单胞菌属是最活跃的菌株,对多种农药有分解作用。今后微生物降解农药的实用化探索研究方向主要是 降解基因的克隆与表达,基因工程技术的利用使人们可按照人类的需要组建具有特殊功能的降解质粒,产生出降解效率高,降解范围广,表达稳定的新菌株。
评价各种污染物的环境生态效应以及被污染环境的生态修复是目前全世界关注的三大主题之一。在环境工程中微生物发挥了重要作用,微生物遗传多样性及其微生物区系变化评价指标的引入,使传统污染物生态风险评价指标体系更加科学和更加完善. 同时,微生物以其独特的适应能力和灵活的代谢方式,被应用于污染环境修复,具有得天独厚的优越性.大量具有污染物降解功能的基因被检测和定位,特异菌株被选育,并开始应用于污染环境修复工程中微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。20世纪早期,基础微生物学方面的最大进展是细菌新种的发现和适当分类(细菌分类学)。当代细菌分类学利用遗传学原理和方法分析微生物种、属间的亲缘关系。遗传分类法是根据核酸分析得到的遗传相关性(Genetic Relatedness)所做的分类。因为这种分类方法是以决定生物表型特征的遗传物质—核酸作为比较的准绳,所以它是一种客观和可信度较高的分类方法。包括DNA(G+C)mol%值(热变性法、CsCl密度梯度离心法)、核酸杂交(DNA-DNA同源性分析、DNA-rRNA同源性分析)、核糖体基因序列的分类(16SrRNA寡核苷酸序列分析、16-23SrRNA基因间隔区序列)、以DNA指纹图谱为基础的微生物分型鉴定(限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)分析、随机扩增DNA多态性分析(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Amplified Polymorphism, AFLP)等)、聚合酶链式反应(PCR)、原位荧光杂交。在近10年的发展过程中,利用分子生物学技术对所有可培养和难培养微生物的16SrRNA进行分析后,推测细菌域中有大约36个进化分支,其中许多分支微生物为不能培养的种群。这一成果是对传统的以形态特征和生理生化特性等多种指标为依据所建立的系统进化关系和分类体系的突破和创新,从分子遗传学角度对生物系统进化的本质进行了诠释。与高等生物相比,微生物的多样性在分子水平上体现尤为突出,不同种群间的遗传物质和基因表达具有很大差异。
分子生物学研究技术向微生物生态学领域的不断渗透,为微生物生态学研究领域注入了新的活力,尤其在微生物多样性、微生物区系分子组成及变化规律以及微生物系统进化研究方面取得了重大突破,许多分子生物学研究方法和理念被应用到微生物生态学研究中,为微生物生态学研究领域注入了新的活力,建立起未能培养微生物(Uncultured Microbe)和不依赖于培养微生物(Culture Independent Microbe)生态学研究方法,使关于微生物多样性、微生物种群动力学、重要基因定位、表达调控及其基因水平转移对生态系统的影响等方面取得了长足的进展,并获得了许多意想不到的新发现。许多悬而未决的问题被解决,从遗传水平上说明了群落结构的完整性。核酸探针检测技术以核酸分子杂交技术为核心,利用探针分析微生物的DNA序列及片断长度的多态性。1985年Mullis发明了聚合酶链式反应技术(PCR),给整个分子生物学领域带来一次重要的变革,使检测混合物中低浓度核酸组成成为可能。尤其对微生物生态研究提供了测度微量微生物群落结构和成分的技术平台,只要1~10个细胞的DNA量即可满足这种方法。根据引物、模板和扩增条件的变化,又衍生出许多新的检测微生物群落多样性的分析方法。这些方法的相同点是,配合精确的电泳分离技术都可形成复杂的微生物指纹,通过多态性分析可得出群落特征及群落与群落之间的相似性。随着引物设计能力不断增强,发展了几种PCR方法,分别有:(1)低分子量RNA指纹,可检测微生物种水平上的基因分类。细菌中的ITS分析,是相关功能的几个基因与长度不同的基因间区域(IGS)连在一起。(3)rep-PCR基因指纹,用引物与原核生物基因间散布的DNA重复单元相连,使PCR产生高特异性和可重复指纹(rep-PCR)来检测生态多样性。最近,一些研究阐述了原核生物原位PCR(PI-PCR)方法检测真核细胞中的基因或基因产物。1990年开始,PI-PCR技术经过了快速发展和不断改进,可以扩增特殊基因。原位PCR可以成功地对目的片断进行定向扩增,并检测单拷贝核苷酸序列。
上世纪70年代起,细菌生理学、生物化学和遗传学已促进了细菌研究水平的很大提高,基因工程得到了飞速的发展。它是在基因水平上,运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,与载体连接,然后导入另一细胞,使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达。细菌既可作为外源基因供体和基因载体进行细胞遗传材料的操作,同时又是基因工程操作中的各种“工具酶”的提供者。可以说,基因工程是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术,它可实现超远缘杂交,因而是最有前途的一种育种新技术。由于这些新技术的发展和应用,许多优良的微生物菌种被选育出来,用于国内外的工业化生产。我国最近几年应用基因工程技术获得的菌株,大量用于酶、维生素、氨基酸、激素、促红细胞生长素及其他一些次生代谢物质的生产。基因工程作为一种新兴技术,尽管近几年来发展较快,但还需要进一步的完善和发展,如目的基因导入真核细胞可以得到较好的表达,但对其导入机理,细胞培养方法等的研究较少。以原核生物为受体细胞,用发酵法大规模制备蛋白质制品的过程中,使稳定的克隆DNA序列得到最大限度的表达尚未实现.除了这些技术上的问题以外,其安全性问题一直备受关注,20世纪70年代,有人认为重组体分子的建立及将其插入微生物会创造出新的有害生物,对人类及环境造成危害,这一说法至今没有被证实,但存在理论上的可能性,尽管如此,基因工程仍然是目前最高效、最理想的育种方法,有着巨大的潜在生产力。
伴随人类基因组计划的顺利开展和实施,微生物基因组计划因其具备的诸多优势成为生命体基因组研究的重要分支,促进了生物信息学时代的到来。通过对微生物基因组的深入研究可以揭示微生物的遗传机制,发现重要的功能基因并且能在此基础上发展疫苗,开发新型抗病毒、抗细菌、真菌药物,将对有效的控制新老传染病的流行,促进医疗健康事业的发展产生巨大影响。所谓基因组研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序,在了解全基因的结构基础上,研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。从分子水平上对微生物进行基因组研究,为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的线索和思路。1994年美国发起了微生物基因组研究计划(M GP)。通过研究完整的基因组信息,获得开发和利用微生物重要功能基因的信息,不仅能够加深对微生物的致病机制、重要代谢和调控机制的认识,更能在此基础上发展一系列与我们的生活密切相关的基因工程产品,包括:接种用的疫苗、治疗用的新药以及诊断试剂和应用于工农业生产的各种酶制剂等等。
病毒因其基因组小,是进行基因组研究最早的生物体,早在1977年就已完成了噬菌体DNA的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的SV40,是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒;此后,许多病毒均已完成了全基因测序,并根据序列的开放阅读框架(ORF)对编码蛋白进行了推导。今后对其后基因组研究的领域会集中在:1.对基因组中与病毒持续性感染相关的基因、基因变异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变,可逃逸机体对E抗原的免疫应答,有利于病毒持续感染。2.病毒与肿瘤的关系:已知EB病毒、人乳头状瘤病毒、乙肝病毒等均与肿瘤相关。对这些病毒的基因组或基因变异研究,有可能揭示部分致瘤的机理,如有报道EB病毒LMP-1基因羧基端缺失30个碱基对,可能具有更高的致癌性。3.病毒变异株或新出现毒株的致病性改变:如近来发现肺出血性汉坦病毒,对人致病的H5禽流感病毒以及复制性特别强的乙肝毒株等。4.病毒编码复制酶基因及其调控的研究:有些病毒具有独特的复制酶,如对人免疫缺陷病毒酶的研究导致开发出有效的抗病毒制剂。还有一些病毒(如丙型肝炎病毒)复制酶的编码基因虽已明确,但未能大量在体外表达,而且对这些酶在细胞内病毒复制中所起的作用也不清楚,延误了抗病毒制剂的开发,应抓紧进行研究。5.病毒受体的研究:已知病毒受体多数是复合型,近来发现人免疫缺陷型病毒的受体除CD4外还有副受体。受体是病毒入侵细胞的第一关,通过全基因组研究将更有利于发现复合的病毒受体。
虽然微生物学在过去的一个世纪取得了长足的进步,但微生物学的研究工作面临的挑战日益艰巨。20世纪早期柯赫的应用研究使得医学微生物学和免疫学有了长足的发展,WHO宣布近30年来,新发现了29种新病原体,病原体的感染机理以及人体自身转而对感染的防御机制被仔细研究,并凭借微生物来大规模生产维生素类药物、多价不饱和脂肪酸、抗癌药物和医用酶制剂等制药产品,制造不易得到的化学产物。但感染性疾患仍然是危害人类健康的重要疾患,尤其是对第三世界国家而言。Prion被确定为疯牛病和人类C-J等病的病原体,肯定了蛋白质颗粒可成为病原体,致使感染人类的微生物日趋复杂。常见致病微生物的威胁不但没有消除,且出现了严重的耐药性问题,如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、克雷白菌,给临床治疗带来巨大困难。HIV在世界范围内肆虐,STD病原微生物尚在蔓延。1993年,肺鼠疫在印度复燃,霍乱弧菌O139型有可能致成世界范围的第8次大流行。同时随着世界人口的急速增加,耕地面积的日渐减少,环境破坏日趋严重,物种消亡逐步加快,微生物学研究任务依然很艰巨。