脂肪醇和脂肪酸酯是重要的化工原料及生物燃料，开发合成细胞工厂实现脂肪醇和脂肪酸酯的生物制造是目前国际领域重要热点。最近，项目组成员、武汉大学刘天罡研究组在构建新型高效生产脂肪醇和脂肪酸酯合成细胞工厂方面取得重要研究进展。为了获得高产脂肪醇的大肠杆菌合成细胞工厂，研究团队首先通过对不同的功能元件-脂肪酰辅酶A还原酶和脂肪酰ACP还原酶进行了比较，最终确定来源于Synechococcus elongatus 的脂肪酰ACP还原酶AAR作为为脂肪醇生产的最优酶，并在大肠杆菌体内构建了最经济有效的合成脂肪醇的代谢途径（图1）。然后通过阻止脂肪酸的氧化降解途径、过量表达乙酰辅酶A羧化酶ACCase，以及筛选脂肪醇高浓度耐受菌等方式得到高产菌株，将该菌产量提高了2.4倍。该菌株在2.5 L 分批补料发酵条件下，在短短的15小时之内即能够获得最高0.87 g/L的产量，生产强度约为0.07 g/L/h, 得率约为 17 mg 脂肪醇/ g 甘油。除此之外，该工作通过体外重组的方法首次鉴定了该条合成途径在大肠杆菌体内将重要中间代谢物脂肪醛还原形成脂肪醇的内源基因adhP。通过体外重组及体内实验数据分析，证明了目前利用大肠杆菌生产脂肪醇的限速步骤是脂肪酰辅酶A将脂肪酰ACP还原为脂肪醛这一反应步骤，因此，提高该酶的活性是后续研究在大肠杆菌合成细胞工厂生产脂肪醇的关键步骤。上述研究结果已经发表在me-tabolic Engineering杂志[1]。
脂肪酸酯是由脂肪酸代谢途径衍生而来的，包括脂肪酸甲脂和脂肪酸乙脂等，其各项性能与化石燃料最为接近，是生物柴油的理想替代品。而各种短链醇，包括乙醇，丁醇等是目前生物汽油研究的热点。研究团队首次将产短链醇的代谢途径和产脂肪酸酯的代谢途径整合在一起，获得的菌株不仅可以生产脂肪酸酯，同时可以获得大量的短链醇（图2）。通过对2-酮酸突进进行改造，异源表达来源于酵母的ARO10和ADH2将氨基酸代谢途径中间体2-酮酸转化为短链醇，结合脂肪酸代谢途径中的其他改造，同时异源表达WS/DGAT基因（来自 Acinetobacter baylyi 的转脂酶）催化短链醇脂肪酸辅酶A发生酯化反应合成脂肪酸短链酯。该合成细胞工厂发酵罐的产量为1008 mg/L的脂肪酸短链酯，同时可以获得800 mg/L的短链醇。目前的生物柴油在温度较低时会发生凝结，因而限制了其在冬季寒冷地区的使用，通过引入支链醇可以降低脂肪酸酯的凝点。为此，通过对大肠杆菌支链氨基酸代谢途径进行改造，引入了来自于Bacillus subtilis 的AlsS (Acetolactate synthase)、来源于酿酒酵母的ARO10 和 ADH2，同时高表达大肠杆菌内源的IlvC (Ketol-acid reductoisomerase)和 IlvD (Dihydroxyacid dehydratase)，用于合成异丁醇，结合高表达TesA’和FadD提高胞内脂肪酸辅酶A含量，异源表达WS/DGAT基因催化异丁醇与脂肪酸辅酶A发生酯化反应合成脂肪酸异丁酯。摇瓶发酵脂肪酸异丁酯产量为206.6mg/L。通过引入异丙醇代谢通路，可以获得异丙脂，产量在145.6mg/L。上述部分研究结果也发表在me-tabolic Engineering杂志[2]。
参考文献
[1] Liu R, Zhu F, Lu L, Fu A, Lu J, Deng Z, Liu T. me-tabolic engineering of fatty acyl-ACP reductase-dependent pathway to improve fatty alcohol production in Escherichia coli. me-tabolic Engineering 2013, 22C:10-21..（资助编号2011CBA00800）
[2] Guo D, Zhu J, Deng Z, Liu T. me-tabolic engineering of Escherichia coli for production of fatty acid short-chain esters through combination of the fatty acid and 2-keto acid pathways. me-tabolic Engineering 2014, DOI: 10.1016/j.ymben.2014.01.003.（资助编号2011CBA00800）
图1：鉴定脂肪醇生产途径中的AAR 和AdhP产物及功能
图2：在大肠杆菌中生产脂肪酸短链酯代谢途径
图3：在大肠杆菌中生产脂肪酸短链酯代谢途径
