Western blot技术服务

一、Western blot概述
        Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。
由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。
 
二、技术服务服务内容
  1、蛋白质抽提与定量；
  2、Western blot
  3、图片分析；
  4、Western blot实验报告提交。
 
三、送样须知，为了保证Western blot实验能顺利进行，样品寄送需满足以下要求：
       顾客提供：组织、细胞、蛋白质溶液等；一抗（如果公司抗体库里没有）。
       运输要求：干冰或液氮包装寄送，广州本地客户可上门收样。
               注：样本应避免各类污染和反复冻融。
 
四、实验报告内容
  1、Western blot蛋白质浓度及电泳上样量；
  2、原始胶片和电子图片、图片分析结果；
  3、Western blot完整的实验报告,包括实验步骤、使用仪器和试剂等。
 
五、实验案例

 
六、服务周期及收费标准: 欢迎登陆  www.fitgene.com   服务热线 400-699-1663

七、服务质量承诺：利用内参精确定量，并提供清晰、客观的western结果。
 
 
附：Western blot 实验步骤
 1、Western blot蛋白质提取：根据实验目的的不同选择不同的裂解液，如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液，同时根据蛋白质提取组分的不同选择不同的方法，如提取核蛋白，细胞质蛋白，膜蛋白等。

 2、蛋白定量，根据蛋白质的提取条件不同，可采取不同的定量方法，如bradford法、BCA法等。

 3、电泳，依据需要检测蛋白的分子量选取分离胶的浓度，分别配置分离胶和积成胶，凝胶凝固后进行蛋白质上样和电泳。

 4、转膜，可采取半干法和湿法转移，当采取半干法转膜时需防止短路：从下到上的顺序：滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸/阴极（bio-rad转膜仪)。

 5、封闭：5%脱脂奶粉或5% BSA封闭过夜或室温1小时,孵育时间可根据实验需要进行改变。

 6、一抗孵育，5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时4度过夜，孵育时间可参考抗体说明书，并加以优化，一抗孵育后TBST洗膜3次，每次5分钟。

 7、 二抗孵育，5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时，TBST洗膜3次，每次5分钟。

 8、显影(ECL法）：将A、B两种底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上，置于压片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒进行曝光，曝光一定时间后取出胶片，浸入显影液中显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，扫描胶片和Western blot 图片分析。