发酵法生产植物激素脱落酸技术

一、天然型脱落酸的理化性质、用途和生产方法1. 理化性质 脱落酸（Abscisic Acid，ABA）是一重要的植物激素，化学名为3-甲基-5-(1’-羟基-4’-氧代-2’，6’，6’-三甲基-2-环己烯-1’-烃基)-2-顺式，4-反式-戌二烯酸。天然脱落酸是右旋体，熔点160~161℃，紫外吸收光谱与溶液pH值有关，在酸性乙醇中最大吸收峰为262nm。旋光度[α]D=395~410°（乙醇）2. 主要用途 天然脱落酸（（＋）－cis, trans Abscisic acid, ABA）与生长素、乙烯、赤霉素、细胞分裂素并列为植物五大类激素，在植物生长发育中起多方面作用：如调节气孔开闭、抑制种子发芽、控制胚胎和种子发育成熟，涉及抗逆作用如脱水、干旱、盐胁迫、低温、病虫害和机械创伤等环境因子应答。作为启动植物体内抗逆基因表达的“第一信使”，脱落酸被誉为“植物伟哥”。ABA在农业、林业等领域有着广泛的应用，归纳起来主要有以下几个方面：a,促进种子、果实的储藏物质，特别是储藏蛋白和糖份的积累，为农作物种子的萌发积蓄营养。在种子和果实发育早期外施ABA，可以达到大大提高粮食作物和果树产量的目的。b,ABA是一种种子萌发的完全可逆的有效抑制剂，用其极低浓度的水溶液对植物种子特别是附加值较高的经济作物种子实施简单处理后有利于种子的长期储存，从而避免了由于储存条件不当引起的种子过早发芽和霉变，效果显著。而且经简单淋洗后种子发芽能力可立即完全恢复，无毒不污染环境。c,提高作物抗寒防冻的能力，用于帮助农作物及经济作物抵抗早春期间的低温冻害以及培育新的抗寒力强的作物品种。美国和欧盟的许多国家广泛将其应用于防止高档草坪如高尔夫球场草坪的冻害。d,可以显著提高植物的抗旱力和耐盐碱能力，有助于充分利用由于自然环境变化与大量化肥长期使用所造成的日益干旱和沙漠化盐碱化的退化耕地。在开发利用中低产田以及植树造林等农林领域有极高的应用价值。e,ABA还有控制花芽分化，调节花期，促进生根的作用，因此在花卉种植领域可广泛应用于延长花卉开放时间以及鲜切花的保鲜等。3. 生产方法 ABA尽管在植物中广泛分布，但其含量非常低，如在山杨芽中ABA含量仅为82ng/g，且其分离提取方法步骤复杂，多用有机溶剂粗提得粗提液，再经纤维素薄层层析，硅胶层析，LH-2柱层析或scp-pak柱层析及反相高效液相色谱纯化，故很难用直接提取法制造大量ABA。 目前化学合成法是生产ABA的主要方法。ABA的化学合成多以芷香酮为起始原料，经多步反应才制得外消旋ABA。而天然产品ABA为其右旋体(+)-ABA，研究表明天然ABA与外消旋ABA在生理作用上存在一定差别，如右旋(+)-ABA可完全抑制Pharbitis nil形成花芽，而外消旋ABA即使在高浓度下也不出现花芽完全抑制现象，为此天然ABA的应用更受重视。但化学合成品原料成本高、工艺路线长、污染大，成品为消旋ABA，尚需拆分、收率低、耗费大，因此开发新的天然型ABA的生产方法势在必行。 微生物发酵法生产天然型脱落酸，是近年来迅速发展起来的生物工程重大发展领域。80年代初，研究人员相继发现某些真菌代谢产物中含有大量右旋(+)-ABA，真菌产生的天然ABA纯度高（>90％）、生理活性强，已成为开发、生产ABA的一条新途径。日本较早采用发酵法生产ABA。目前国内仅有两家企业可以生产脱落酸，分别是四川龙蟒福生和江苏双沟酒业，但是因为成本还没有降到农民可以接受的程度因此无法实现大规模田间施用，龙蟒福生的产品已出口到美国。二、技术简介 微生物发酵法产生ABA具有纯度高、生理活性强等优点，通过选育ABA高产菌株，应用发酵法生产ABA可大幅度降低成本，并具有安全、方便、污染少等优点。我们建立了快速、简便的脱落酸产生菌筛选方法，筛选获得高产ABA灰葡萄孢菌株，并对该菌株进行了紫外、化学、激光等多种诱变，还优化了发酵工艺，使该菌株生产ABA的水平达到2.3～4.6g/kg培养物（实验室水平达到8.1g/kg），发酵时间从25天缩短到7～10天，同时建立了快速分离、纯化方法使产品纯度大于98％，总收率大于60％，所得产品结晶经红外、H1- NMR、质谱、旋光测定、生物活性测定证实本品为纯天然型。该工艺路线步骤较短，操作简单，重现性好，是一条生产天然型ABA的创新性工艺。同时本公司还首次建立应用Mailaby显色法快速测定ABA的含量，可对ABA产生菌的选育，中间体分析及成品的质控进行有效地检测。三、技术优势生理活性强：所得产品为生理活性强的天然型ABA(右旋),而用化学合成法生产的是活性较差的外消旋型ABA.产量高：发酵产量2.3g/kg~4.6g/kg（实验室水平达到8.1g/kg），脱落酸纯品产量可达1.7g/kg~3.4g/kg，生产周期短，居国内外之首（见表1）。成本低：用本工艺生产天然脱落酸成本低廉，是目前国内外唯一可将天然脱落酸纯品（纯度>98%）生产成本降至每公斤2万元以下的工艺方案（见表2），可迅速以低价抢占市场，率先实现脱落酸的大规模应用。工艺成熟度高：已经完成中试实验，并已通过省级科技成果鉴定。工艺结果稳定，仅需3个月内即可完成车间设计改造和投料生产。质量控制方法先进：本公司发明的极具创造性的M氏显色法检测技术，对生产过程中的质量控制极具意义，鉴定过程非常方便快捷，是国内外唯一的脱落酸低成本快速检测技术。原辅料来源广泛，价格低廉，且不需要过于特殊的仪器设备，一次性投资成本低，便于工业化推广应用。市场广阔：仅国内的市场潜在需求即以百亿计，国际市场更不可估量。生产技术垄断：国际上只有日本和美国可以小规模生产，但因为成本居高不下，造成国际脱落酸价格是黄金价格的百倍；国内目前仅有两家企业拥有脱落酸生产技术，且工艺水平比本项目落后许多，与本项目相比较没有任何优势。技术垄断保障下的市场垄断：本项目至少可以保证投产后五年以内国际上没有更有竞争力的技术工艺出现（我们掌握国际领先的脱落酸产生菌种高通量筛选方法，即使如此，至少需要5年的时间才可能筛选出与本项目媲美的高产菌种）。四、市场预测、产值和利润本工艺是目前国内唯一对脱落酸大田施用具有实用意义的技术，价格可降到农民接受的水平。脱落酸可制成农用制剂应用于大田，应用领域包括抗寒、抗旱、增加作物耐盐力、种子保藏等，社会经济效益十分显著，如以北京进行的小田试验为例：将新冬2号小麦用1Oppm脱落酸进行浸种处理24小时，在10月26日播种在试验地，当麦苗刚出土时就进入寒冬，次年返青时，对照的存活率为51.4％，而ABA浸种处理的高达96.3％，成活率几乎是对照组的两倍，仅此一项每年即可创造上亿元的社会经济效益。脱落酸农业上使用浓度为10ppm，每克可配制0.1吨施用，以每亩田喷洒10公斤计，每亩田需0.1克脱落酸（10×10-6克/毫升×10×103 毫升/亩=0.1克/亩）。目前我国有耕地面积13.7亿亩，即使市场占有率仅10%，对脱落酸的需求也可达每年13.7吨（13.7亿亩×10%×0.1克/亩= 13700000克=13700KG）。另外，脱落酸还可作为试剂用于植物培养及花卉园艺方面，如延长花期、促进生根等，目前国内在这方面的应用已很成熟，具有较为稳定的销量。目前国际上天然型脱落酸试剂市售价每毫克200美元(Sigma公司)，采用本工艺生产的脱落酸售价可降低到0.01美元/毫克，价格仅为Sigma公司的1/20000，具有很强的国际市场竞争力，是化工进出口领域的一匹黑马。本工艺是目前全球成本最低、产量最高的脱落酸大规模生产技术，项目投产后将形成显著的成本优势，从而可造成国际脱落酸市场价格的雪崩，进而垄断国际脱落酸市场。脱落酸目前已在我国华南地区实现了大面积农业应用，主要应用在亚热带果树等经济作物。以海南省为例，海南有160多万亩芒果、荔枝、龙眼，反季节培育每年用乙烯利和多效唑几千吨，但是用后毒副作用非常强。经试验用低残留、毒副作用小的“天然脱落酸”可很好的替代，反应效果显著。海南全省2004年上半年采用脱落酸替代化学合成类农药已得到较为普遍的应用，而2005年将全面应用脱落酸，预计仅海南一省的脱落酸需求量高达10吨以上。