青霉素新菌种和技术转让

青霉素新菌种与工业生产由产黄青霉工业化生产青霉素G或V的工艺流程如图-1所示，其中发酵生产的工艺控制要求及典型的发酵过程曲线分别如表-1所示。对这一工艺过程需要特别注意或说明的事项有：(1)生产菌种的长期保存要采用孢子悬浮液液氮低温（-196℃）存放或真空冷冻干燥管冷藏（4℃）的方法，而不采用传统的沙土管保藏方法，以便在较长时间（5~10年）内保持菌种的存活和生产能力稳定。(2)琼脂斜面种子（孢子）密封后在4~15℃下可以短时间保存，但最好不要超过3个月。(3)米孢子的基质可以是大米或小米，培养成熟后密封可以在4~15℃下保存不超过3个月；如果在密封前真空干燥，则可以保存不超过6个月。(4)种子罐以达到对数生长的后期为培养成熟指标，不能随意延长或缩短培养时间；同时要考虑培养液的流动性，以不影响通过管道向发酵罐接种的速度为宜。(5)发酵罐的发酵条件要严格按工艺要求（见表-1）进行控制，特别是各项补料要适应工艺对溶氧、pH及维持量的要求，不能过量，也不能不足；为了减少过程空气湿度对发酵液体积的影响，在湿度偏高或偏低的季节，要适当提高或降低用于补料的糖液浓度。(6)氨水既作为发酵的氮源，又用来调节发酵过程中的pH，它的补入要根据发酵液的pH和铵氮含量与补硫酸铵协调进行。(7)发酵液过滤要尽量提高速度，缩短时间，为此一般需要在过滤前对发酵液进行絮凝处理，絮凝剂的加入量随絮凝剂种类不同而异，以达到最大絮凝效果而不过量为宜。(8)除种子制备和发酵过程要严防杂菌侵入外，提取的各工序也应尽量保持无菌，因为污染细菌极有可能产生能破坏青霉素的青霉素酶；特别是过滤，由于操作时间长，料液营养丰富，容易滋生杂菌，故必须定期对设备和过滤介质进行清洗和灭菌，必要时可在过滤前加入4‰福尔马林防腐。青霉素对热、酸、碱都不稳定，而萃取操作正好处于不稳定pH范围内，故萃取过程要尽量降低温度，缩短时间，以减少青霉素的降解；离心萃取速度快，青霉素在不稳定pH下维持时间短，是目前生产上普遍采用的方法。(9)由于一次萃取对象的发酵滤液中含有不少可溶性蛋白质，容易在萃取界面形成乳化层，影响萃取和相分离，故在萃取过程中要加入适量破乳剂。(10)结晶操作要掌握好晶体形成的速度，以达到理想的晶形和晶粒大小；为此，必须控制结晶时的温度和结晶反应剂加入的速度，并保持适当转速的搅拌。(11)在整个提取过程中使用的过程水、溶媒及其它原辅料，都要有严格的质量要求，设备、周围环境和操作人员也要严格保持清洁，以避免带进杂质和杂菌，影响产品质量。表-1 青霉素发酵的主要工艺控制点操作变量工艺控制点操作变量工艺控制点发酵罐容积50~200 m3发酵温度~25℃装料率~80%发酵液pH~6.5搅拌输入功率3~4 kW/m3初始菌体浓度通气率40~80 Nm3/(m3•h)补料液中葡萄糖浓度空气压力（表压）0.2 MPa葡萄糖补加率发酵液上方空气压力（表压）0.03~0.06 MPa发酵液中铵氮浓度0.25~0.34 kg/m3液相氧体积传递系数（kLa）200 h-1发酵液中苯乙酸浓度发酵液中溶氧浓度>30%饱和度发酵时间180~240 h菌种产青霉水平120000U/ml菌种来源意大利产 黄 青 霉真空冷冻干燥或液氮保藏孢子斜 面 孢 子琼脂斜面培养基上25℃培养7~9 d 米 孢 子用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25℃培养6~7 d 种 子 罐用孢子米粒或孢子悬浮液接种，26℃通气、搅拌培养60~68 h 发 酵 罐用种子罐按10%~15%体积接种，在25℃及通气、搅拌下补料分批培养200~240 h发 酵 液冷却至5℃左右，絮凝、过滤发 酵 滤 液用15%硫酸调节pH 2.0~2.2，按1∶3.5~4.0体积比加入乙酸丁酯（BA）及适量破乳剂，在5℃左右进行逆流萃取一次BA萃取液按1∶4~5体积比加入1.5%NaHCO3缓冲液（pH 6.8~7.2），在5℃左右进行逆流反萃取一 次 水 提 液用15%硫酸调节pH 2.0~2.2，按1∶3.5~4.0体积比加入乙酸丁酯（BA）在5℃左右进行逆流萃取二次BA萃取液按150~250 g/Gu青霉素加入粉末活性炭，搅拌15~20 min脱色，然后过滤脱 色 液按脱色液中青霉素含量计算所需K量的110%加入25%乙酸钾丁醇溶液，在真空度＞0.095 MPa及45~48℃下共沸结晶结晶混悬液过滤，先后用少量丁醇和乙酸乙酯各洗涤晶体两次湿 晶 体在＞0.095 MPa的真空及50℃下干燥青霉素工业盐图-1青霉素工业盐（青霉素G或V的钾盐）的工业生产流程