黄原胶( Xanthan Gum) 是由黄单孢菌(Xanthomonas campest ris) 利用碳水化合物而产生的一种微生物胞外多糖,由于其具有良好的水溶性、增粘性、假塑性和耐酸碱、耐盐及耐酶解的能力,广泛的应用于石油、食品、纺织、染料、造纸等工业领域,是一种极具市场的微生物多糖产品[1 - 3 ] 。关于黄原胶发酵已有众多的研究报道,但这些研究大多控制发酵过程在恒温的条件下进行 ,虽然关于温度对黄原胶发酵过程的影响已有较多研究,并有关于黄原胶发酵温度优化控制的报道 ,但未见有温度对黄原胶质量影响的报道。由于所采用菌种与发酵培养基及发酵条件的差异,这些报道存在诸多不一致的地方,国内未见有黄原胶发酵分段控温的报道。本文研究了分段控温黄原胶发酵过程,并与恒温发酵过程进行比较,以期为黄原胶发酵过程的工业化开发提供参考。
1 材料与方法
1. 1 菌 种
实验采用甘蓝黑腐黄单孢菌SUB - 11 菌株(Xanthomonas campest ris SUB - 11) ,该菌种由上海农药研究所提供,上海化工研究院菌种室保存。
1. 2 培养基
种子培养基: 琼脂为24 g·L - 1 ,蔗糖为15 g·L - 1 ,蛋白胨为15 g·L - 1 ,酵母膏为2 g·L - 1 ,谷氨酸钠为2. 4 g·L - 1 ,KH2PO4 为1 g·L - 1 , NaCl 为1 g·L - 1 , FeSO4 为0. 1 g·L - 1 。用1 mol·L - 1的NaOH溶液调制pH = 7 ±0. 1 ,121 ℃灭菌30 min。
罐发酵培养基:玉米淀粉为30 g·L - 1 ,复合氮源为5 g·L - 1 ,无机盐为3 g·L - 1 ,用开水定容,加泡敌(植物油) 至适量,用1 mol·L - 1的NaOH 溶液调制pH = 7 ±0. 1 ,121 ℃灭菌30 min。
1. 3 培养条件
种子培养:将保存的生产菌斜面接种于茄子瓶后,在生物培养箱内恒温(28 ℃) 培养2～3 d ,直接作为罐发酵的种子。
罐发酵培养:将培养基定容3. 5 L ,通气量为1vvm ,通过自动溶氧控制仪调节转速,以保证整个发酵过程溶氧量在饱和溶氧的20 %以上,发酵温度在以后分别注明。
1. 4 发酵装置
采用日本Mituwa 公司制造的KMJ - 5 型通气式搅拌发酵罐,其结构及详细尺寸见参考文献 ,该发酵罐可以自动调节温度与转速,控制发酵过程的pH 及溶氧量。
1. 5 工艺流程
保存的生产菌斜面→茄子瓶→发酵罐→放罐。
1. 6 分析方法
1. 6. 1 菌体质量浓度的测定
准确称取一定量的发酵液,用蒸馏水稀释到黄原胶质量浓度低于5 g·L - 1 ,离心40 min ,倒去上层清液,离心所得沉淀经硝化后用微量克氏定氮测定总氮含量,然后按下式换算成菌体质量浓度。菌体质量浓度= W (氮) / V(发酵液) 。
1. 6. 2 黄原胶质量浓度的测定 准确称取一定量的发酵液,用蒸馏水稀释到黄原胶质量浓度低于5 g·L - 1 ,离心40 min , 取上层清液,加2 倍清液体积的酒精,沉淀,并用酒精洗涤沉淀物3 次,干燥后称重,即可得黄原胶的质量浓度。
1. 6. 3 总糖浓度的测定
准确称取一定量的发酵液,用蒸馏水稀释到黄原胶质量浓度低于5 g·L - 1 ,离心40 min , 取上层清液,加酸水解,中和,然后采用菲林试剂热滴定法测定还原糖含量,此即发酵液中总糖的含量。
2 结果与讨论
2. 1 恒温黄原胶发酵过程
在5 L 通气式搅拌发酵罐中,非溶氧限制的条件下,对恒温黄原胶发酵过程进行了研究,并将在28 ℃与33 ℃黄原胶发酵数据进行比较。由图1 (a)可以看出,在发酵的起始阶段(生长期前期) ,菌体在33 ℃的生长较快,此时33 ℃的菌体质量浓度高于28 ℃时的菌体质量浓度,但自生长期的后期(13 h以后) ,28 ℃的菌体质量浓度高于33 ℃时的菌体质量浓度,在稳定期(20 h 以后) ,28 ℃的菌体浓度高于33 ℃时的菌体浓度18 %左右,同时可以发现,在温度33 ℃时,菌体亦较早的进入稳定期与衰亡期,具有较短的发酵周期。由图1 (b) 可以看出,在温度33 ℃时,菌体产胶提前,发酵周期明显缩短,但终产胶质量浓度与28 ℃相比,下降9 %左右。由图1 (c)可以看出,在温度33 ℃时,发酵液中总糖质量浓度在整个发酵过程中,均低于28 ℃时的总糖质量浓度。
2. 2 分段控温黄原胶发酵过程
由于在温度为28 ℃时有利于菌体的生长,而在温度为33 ℃时有利于产胶,实验测定了在发酵过程中菌体处于生长期时(发酵的前20 h) 保持发酵温度为28 ℃,而产胶阶段维持温度33 ℃的发酵过程数据,并与恒温28 ℃发酵过程数据进行比较,如图2所示。由图2 (a) 可以看出,在发酵后期分段控温的菌体质量浓度要低于恒温发酵过程,这说明分段控温使菌体衰亡期提前。由图2 (b) 可以看出,分段控温可以使产胶质量浓度由恒温时22. 4 g·L - 1提高到24. 5 g·L - 1 ,同时也可以看到,对于分段控温发酵过程而言,在发酵40 h 后,产胶质量浓度基本保持不变,这说明可以将发酵周期缩短至40 h 。由图2 (c) 可以看出,分段控温相对于恒温发酵过程而言,可以使发酵营养物质利用得更彻底,有利于发酵液的后处理。
2. 3 黄原胶发酵过程分析
黄原胶发酵过程实际上是黄单孢菌利用外界营养物质来维持菌体生存、生长和繁殖并产生相应代谢产物的过程,是一个具有完整酶调节体系的一系列酶反应的综合体现。发酵过程中菌体质量浓度的变化是菌体生长繁殖及菌体死亡的综合作用的结果,恒温黄原胶发酵的实验中,在发酵的起始阶段,菌体在33 ℃的菌体质量浓度高于28 ℃时的菌体质量浓度,但自生长期的后期,28 ℃的菌体质量浓度高于33 ℃时的菌体质量浓度,这是由于在发酵初期,较高温度有利于菌体生长繁殖,尽管温度较高加快了菌体的死亡速率,而此时菌体的整体质量浓度较低,营养丰富,综合表现为前者居主导地位,但自生长期的后期,菌体的整体质量浓度已较高,部分营养物质(如氮源) 已成为限制性底物,而使得后者居主导地位。对于产胶而言,由于温度越高,酶反应度越快,同时酶的失活速率也加快,因此,对于恒温发酵过程而言,要获得最大的产胶浓度,存在一个最适温度,另外,较高温度有利于缩短发酵周期。对于底物消耗而言,温度升高,菌体代谢加快,底物消耗速率加快。
温度对黄原胶发酵的影响,不仅反映在产胶质量浓度上,同时对产品质量也有一定的影响,主要表现在丙酮酸的含量及胶的表观粘度,在恒温发酵过程中,温度为28 ℃时丙酮酸的质量分数及胶的表观粘度分别为2. 68 %与1 080 Pa·s ,而温度为33 ℃时丙酮酸的质量分数及胶的表观粘度分别为1. 84 %与790 Pa·s ,28 ℃时黄原胶的品质明显优于33 ℃时的黄原胶。对于分段控温而言,胶质量与28 ℃恒温发酵相当(丙酮酸的质量分数及胶的表观粘度分别为2. 59 %与1 020 Pa·s) 。这说明在菌体生长期,温度对合成黄原胶合成酶系的组成有一定的影响,温度对黄原胶影响不仅表现在酶的活性调节上,也表现在酶的合成方面,在此方面的研究,还有待进一步的深入。
