黄原胶是一种由野油菜黄单孢菌分泌的中性水溶性多糖,又称汉生胶。其结构是由重复的五糖单位构成,主链与纤维素相同,即由β 1,4糖苷键相连的葡萄糖构成,3个相连的单糖组成其侧链:甘露糖→葡萄糖→甘露糖[1]。黄原胶由于其独特的剪切稀释性质,良好的增稠性,理想的乳化稳定性,对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性,以及对人体的完全无毒害等许多优良的特性,在食品、石油、医药、日用化工等十几个领域中有着极其广泛的应用。但同时,黄原胶的应用也产生了一些问题。采油过程中使用黄原胶可提高采油率,但也增加了原油的粘度,使后续工艺如油料运输及产品纯化的成本增高,为此需要找到能方便降解黄原胶的方法。此外,由于寡糖具有抗病毒、抑菌、植物诱抗、提高免疫力等功能,由植物致病菌分泌的黄原胶降解得到的寡糖是否也具有某种生物活性,也激起了人们强烈的兴趣[2～4]。降解黄原胶的常用方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶解法以其降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境没有污染等优点成为黄原胶降解的首选途径。自1980年代Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等第1次报道用枯草芽胞杆菌发酵过程中分泌出的黄原胶酶来降解黄原胶以来,国外学者进行了较多的报道。目前商品化的黄原胶酶价格比较昂贵,并且其生产受专利保护,而国内尚未见有黄原胶酶的报道。我们从土壤里分离筛选出了1种可以产高活性黄原胶酶的菌种,进行了初步鉴定,并对其产酶特性进行了研究,得到了适宜产酶条件,为分离提取高活性黄原胶酶打下了基础。
1 材料与方法
1.1 菌种采样及筛选
从野外收集土样若干,将土样悬浮于灭菌后的生理盐水中,进行梯度系列稀释后,按常规方法涂于黄原胶平板培养基,于30℃培养箱中培养过夜。分别挑出单个菌落的一部分接种于黄原胶平板,于30℃培养箱培养过夜,作为保留菌种;另一部分接种于选择性液体培养基,并于30℃振荡培养(200ｒ/ｍｉｎ),观察培养基的粘度变化。1.2 发酵产酶将活化后的黄原胶降解菌按1%接种量接种至装有100ｍＬ黄原胶液体培养基的250ｍＬ三角瓶中培养,30℃,旋转式摇床转速为200ｒ/ｍｉｎ,培养过程中每间隔一定时间取样,分别测定发酵液的ＯＤ620和上清液中的还原糖含量(ｐ Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄｈｙ ｄｒａｚｉｄｅ,ＰＡＨＢＡＨ法[5])及粘度。所用黄原胶液体发酵培养基的组成为:黄原胶4 5ｇ,葡萄糖0 8ｇ,蛋白胨1ｇ,酵母浸出粉1ｇ,调ｐＨ至7.0左右,定容至1Ｌ。
1.3 菌种鉴定根据《一般细菌常用鉴定方法》[6]和《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[8]对供试菌属的特征进行鉴定。
1.4 酶活力的测定方法
将200μＬ发酵液与200μＬ底物(0.25%黄原胶水溶液)混合后,ｐＨ5.9,于30℃水浴中反应45ｍｉｎ,立即取200μＬ反应液加入到750μＬ5%ＰＡＨＢＡＨ(Ｓｉｇ ｍａ)和ＮａＯＨ(5%)的混合液中,在120℃下加热15ｍｉｎ,用酶标仪测定ＯＤ405。黄原胶酶的酶活力定义为:每分钟催化形成相当于1μｍｏｌ葡萄糖的还原末端所需的酶量为1个酶活力单位。
1.5 仪器与试剂Ｊｅｎｗａｙ公司4330型ｐＨ计。太仓市华美生物仪器厂ＱＨＺ 98Ａ全温振荡培养箱。对羟基苯甲酸酰肼(ｐ Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄｈｙｄｒａｚｉｄｅ)购自Ｓｉｇｍａ公司。其余试剂均为国产分析纯。
2 结果与讨论
2.1 菌株的筛选与鉴定
从黄原胶平板培养基上挑取出能使选择性液体培养基粘度明显变稀的菌落,在黄原胶平板上划线培养,选择单菌落,用选择性液体培养基进行复筛,经对培养过程中培养液粘度下降程度和速度的比较,选出1株对黄原胶降解能力最强的菌落作为研究用菌,并命名为ＸＴ-11。黄原胶降解菌ＸＴ-11在幼龄时期为杆菌,大小约为(0.4～0.6)×(1.0～2.0)μｍ,呈直杆形或稍弯曲,但在1周以上的培养物中,只存在0 5×0 5μｍ左右的类球状细胞。该菌为革兰氏阴性,抗酸性染色阴性,不运动,不形成芽孢,有鞭毛,能利用多种糖类基质。该菌的氧化酶反应为阴性,而过氧化氢酶反应为阳性;不呈现卵磷脂酶和脲酶活性;ＸＴ-11菌不能水解淀粉、纤维素、七叶苷、酪素、明胶和油脂等,但能够分解果胶;甲基红试验阳性,石蕊牛奶反应为暗红色产酸;能够由色氨酸生成吲哚并且能够产生硫化氢;硝酸盐还原呈阴性反应;对半乳糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖的氧化发酵实验检测发现,ＸＴ-11菌对上述各种糖均属发酵型代谢。由《伯杰细菌鉴定手册》初步推测其属于鞘氨醇单胞菌属(Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ.)。
2.2 发酵将黄原胶降解菌ＸＴ-11接种于黄原胶液体培养基中培养,并测定培养过程中的细菌浓度、还原糖含量和粘度的变化,结果如图1。
选择性液体培养基组成为:黄原胶2.5ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ4 0.5ｇ,ＫＨ2ＰＯ4 3.0ｇ,Ｋ2ＨＰＯ4 3.0ｇ,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.2ｇ,ＦｅＣｌ3·6Ｈ2Ｏ16.7ｍｇ,ＣａＣｌ2·2Ｈ2Ｏ0.66ｍｇ,ＺｎＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.2ｍｇ,ＣｕＳＯ4·5Ｈ2Ｏ0.2ｍｇ,ＭｎＳＯ4·4Ｈ2Ｏ0.2ｍｇ,ＣｏＣｌ2·6Ｈ2Ｏ0.2ｍｇ,Ｈ3ＢＯ3 0.1ｍｇ,ＮａＮＯ3 2.0ｇ,Ｎａ2ＭｏＯ4·2Ｈ2Ｏ0.3ｍｇ,定容至1Ｌ。
黄原胶平板培养基的组成为:琼脂粉20ｇ,蛋白胨1ｇ,酵母浸出粉1ｇ,黄原胶3ｇ,葡萄糖2ｇ,用水定容至1Ｌ。
基础培养基组成为:黄原胶4.5ｇ,ＭｇＳＯ4 0.5ｇ,Ｋ2ＨＰＯ4 2.5ｇ,ＮａＣｌ1ｇ,调ｐＨ至7.0左右,定容至1Ｌ。
当有还原糖(在发酵培养基中加入了少量的葡萄糖来加快菌株的最初生长速度)存在时,发酵液的粘度没有下降,说明没有黄原胶酶的出现,在发酵1～2ｄ后,发酵液中的葡萄糖耗尽,该菌株开始分泌黄原胶酶降解黄原胶(现象反映为还原糖的生成以及发酵液表观粘度的下降),因此推测该酶为诱导酶。此外,发酵液中还原糖的大量生成滞后于发酵液粘度的大幅降低,说明其中含有主链酶(ｘａｎｔｈａｓｅ),随后的还原糖量持续升高则说明了发酵液中侧链酶(ｘａｎｔｈａｎｌｙａｓｅ)的存在。
2.3 发酵条件的研究
2.3.1 氮源对发酵的影响
首先考察了氮源物质对发酵产酶的影响,向基础培养基中加入1%不同种类的氮源,培养72ｈ后,测定菌体生物量及酶活,结果见表1。
从表1可以看出,硝酸铵发酵水平较高,而且来源容易,因此选其作为发酵培养基的氮源物质。
2.3.2 碳源对发酵的影响
向基础培养基中加入1%的硝酸铵及1%不同种类的碳源,培养72ｈ后,测菌体生物量及酶活,表2表明,葡萄糖效果最好。
2.3.3 初始ｐＨ对菌体生长及发酵产酶的影响 用ＨＣｌ和ＮａＯＨ调节发酵培养基的ｐＨ,灭菌后用同一制备的菌悬液接种,在所确定的优化条件下,考察了发酵培养基初始ｐＨ值分别为6、6.5、7、7.5和8时发酵液的黄原胶酶活性及菌体密度,结果显示(图2),初始ｐＨ为7.0时发酵液产生的黄原胶酶活性最高,菌体密度也达到最大,因此发酵过程应该在中性条件下进行。
2.3.4 通气量对菌体生长及发酵产酶的影响在250ｍＬ三角瓶中分别加入不同体积的培养基,各接1%种子液,在30℃,ｐＨ7.0,200ｒ/ｍｉｎ培养72ｈ后,测定各发酵液的酶活及菌体密度。结果显示(图3),摇瓶装液量为30ｍＬ时其发酵液的酶活以及菌体生物量达到最高,因此可以确定最佳摇瓶装液量为30ｍＬ。
2.3.5 温度对发酵产黄原胶酶的影响分别考察了25、30和35℃下发酵液黄原胶酶活力随时间的变化规律,其他发酵条件为:摇瓶装液量为30ｍＬ,初始ｐＨ为7.0,接种量为1%,摇床转速为200ｒ/ｍｉｎ。结果可知(图4),在发酵温度为30℃时酶活最高。
2.3.6 温度对菌体生长的影响分别考察了25、30和35℃下发酵液菌体密度随时间的变化规律,其他发酵条件为:摇瓶装量为30ｍＬ,初始ｐＨ为7.0,接种量为1%,摇速为200ｒ/ｍｉｎ。结果可知(图5),在发酵温度为30℃时可获得最大菌体量。
2.3.7 底物浓度对发酵产黄原胶酶的影响考察了底物浓度分别为0.5%、1%和1.5%时发酵液中黄原胶酶活力随时间的变化规律,其他发酵条件为:摇瓶装量为30ｍＬ,初始ｐＨ为7.0,接种量为1%,摇速为200ｒ/ｍｉｎ。结果可知(图6),在底物浓度为1%时酶活最高。
2.3.8 底物浓度对菌体生长的影响考察了底物浓度分别为0.5%、1%和1.5%时发酵液菌体生长随时间的变化规律,其他发酵条件为:摇瓶装量为30ｍＬ,初始ｐＨ为7.0,接种量为1%,摇速为200ｒ/ｍｉｎ。结果可知(图7)在底物浓度为1%时菌体生长量最高。
2.3.9 种龄及接种量对发酵的影响
按不同接种量将不同种龄的液体种子接入发酵培养基中,16～24ｈ的种子产酶较高,而接种量的影响不大。
3 结论
文中对影响鞘氨醇单胞菌ＸＴ-11菌株产黄原胶酶的主要因子进行了研究,筛选出有利产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明,酶形成的适宜温度为30℃,培养基适宜起始ｐＨ为7.0,培养基适宜底物浓度为1%,摇瓶发酵用250ｍＬ三角瓶装液30ｍＬ酶活力较高。适宜种龄为16～24ｈ,接种量对发酵的影响不大。
上述结果对工业化利用鞘氨醇单胞菌发酵产黄原胶酶具有一定的指导作用,并且对研究鞘氨醇单胞菌产酶机制提供了重要依据。继续探讨各因子之间的相互影响对产酶的协同作用,阐明各因素最佳水平对产酶的作用机理,能进一步提高鞘氨醇单胞菌ＸＴ-11的产酶率和促进酶学理论的发展。
