脑膜炎球菌性脑膜炎是人类的主要急性呼吸道传染病之一。流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎。根据荚膜. 多糖特性的不同至少可分为l3个血清群：A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z。W135菌群特异性荚膜多糖结构为N-乙酰神经氨酸-a(1-4)半乳糖-a(2-6)。经研究表明⋯脑膜炎球菌的致病性与许多毒力因子有关，主要有脂多糖(LPS)，荚膜多糖(cPs)，外膜蛋白(OMP)以及IgA蛋白酶等。中国目前流脑仍以A群NM为主要致病菌，2004年入冬以来中国各地区散发C群相关病例。亚洲及非洲地区亦发生了W135群流脑局部爆发[2]，现已有A、C、Y、W135和各型单价和多价多糖疫苗在世界各流行地区广泛应用。为研究和制备A、C、Y、W135四价多糖疫苗，需要各型菌群的规模化培养，参照A群流脑菌苗的生产工艺[H]，实验中针对细菌生长代谢中对生长环境的特殊要求，优化了W135脑膜炎球菌培养基中的葡萄糖浓度、培养温度、pH、接种浓度、溶氧及搅拌速度等条件，进行了深入的研究，初步掌握了W135脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢变化规律，取样测定随时间变化的细菌浓度、糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度、pH、溶氧等参数情况，并予以有效控制。对W135群进行最适培养条件试验结果总结如下。
材料和方法
1 材料
1.1 菌种及来源
W135群脑膜炎球菌CNCC29037株，由中国医学细菌保藏管理中心提供。
1.2 试剂
10％羊血普通琼脂培养基，流脑半综合固体培养基，北京生物制品研究所配制。
1.3 仪器
二氧化碳孵箱、标准比浊管、50L、500L发酵罐、连续流离心机、显微镜。
2 方法
2.1 菌种传代及培养
将W135群脑膜炎球菌(29037)株菌种开启后，接种于10％ 羊血普通琼脂培养基上，于35—37℃ ，8％二氧化碳环境培养l4～18h。将固体培养基上菌落传于半综合琼脂培养基进行二代菌种扩增lO一12h后同上法转种于50L发酵罐。
2.2 细菌发酵培养
刮取二代菌种于50L发酵罐(20L流脑半综合液体培养基)培养，监控细菌生长情况，并对细菌生长过程中的温度、pH、通气量、搅拌速度进行控制，使之适合于细菌生长。
2.3 细菌生长曲线
在择优确定菌种接种浓度，生长温度，pH，通气量，搅拌速度的前提下，描绘细菌生长曲线，了解和确定收获期。
2.4 细菌浓度的测定
用标准比浊管比浊测定细菌浓度了解细菌生长现状，调整各项参数。
2.5 细菌形态观察
培养过程中于不同时段取样进行革兰氏及荚膜染色，在显微镜下观察细菌形态及细菌荚膜丰厚度。
2.6 多糖复合物收集
培养终止后用l％ 甲醛杀菌，连续流离心收集上清，加Cetavlon沉淀剂，再次连续流离心收集沉淀即为多糖复合物。
结果
1 流脑半综合液体培养基不同葡萄糖浓度对细菌生长的影响
W135群脑膜炎球菌生长过程中葡萄糖是其主要碳源，取葡萄糖加量为流脑半综合液体培养基的0.5％ 一1.25％ ，图1显示细菌浓度及荚膜多糖产量与葡萄糖浓度有直接的关系，通过试验选择半综合培养基中补加l％的葡萄糖，无论细菌浓度及荚膜多糖产量都达到很好的效果。
2 不同培养温度对WD5群脑膜炎球菌生长的影响
培养温度是影响脑膜炎球菌生长和控制细菌代谢的重要因素，适宜的温度有利于脑膜炎球菌生长。而温度的升高和降低都会对多糖的获取产生影响。采用36±0.2℃ 、36.5±0.2℃ 、37±0.2℃ 培养条件分别进行培养时，培养条件在36±0.2℃细菌浓度和多糖复合物产量都较低，37±0.2℃培养可获得较高的细菌浓度但多糖产物不是很高。而36.5±0.2℃培养时虽然细菌浓度小于37±0.2℃ 培养时的细菌浓度，但所获得的多糖复合物却高于37±0.2℃培养。见图2、图3。
3 培养时间的确定
将W135群脑膜炎球菌接种于50L发酵罐培养，于培养过程中4、6、7、8、9、10、11h时取样测定菌种浓度，结果显示，7—8h细菌浓度达到高峰，此后细菌生长缓慢，8h后取样涂片镜检细菌及细菌荚膜形态均比7—8h收获样品有所下降。罐培养3h后可见明显生长，pH呈缓慢下降，培养到4—7h时，pH呈有规律下降，进入对数生长平台期，8h以后，pH下降缓慢，继而出现pH回升，说明有溶菌现象，应尽快终止培养。从而确定7—8h为收获的最佳时机，见图4。
4 不同菌种接种浓度对W135群脑膜炎球菌生长的影响
将W135群脑膜炎球菌菌种浓度分别按0.5-5.O亿／ml范围(0.5、1.0,2.0、3.0,4.0、5.0 亿／ml)接种于50L菌种罐培养，按实验确定条件培养7—8h，测定生长浓度和荚膜多糖产量。菌种接种浓度太高，使之及早进人对数生长期，细菌生长浓度高，但产糖却不一定呈正比。菌种接种浓度太低，则延缓细菌生长，也不利于多糖产量。图5所示W135群菌种的适宜接种浓度为2.0—3.0亿／ml，见图5。
5 不同pH值对W135群脑膜炎球菌生长的影响
根据脑膜炎球菌能发酵葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气的生物学特性，酸性环境不适于细菌的生长，培养结果显示，进人生长周期后，维持pH6.0—7.5之间，较适宜细菌生长，且较有规律、稳定。W135群链球菌生长的最适pH值在6.5—7.5之间，pH高于8和低于5都不适合W135群脑膜炎球菌生长，见图6。
6 罐培养过程中溶氧量及搅拌速度对W135群脑膜炎球菌生长的影响
流脑W135群是一种兼性厌氧菌，罐发酵过程中的供氧取决于通气量及搅拌速度，为此分别进行了不同通气量和不同搅拌速度对溶氧进行研究分析，通气量从0.1—4.0 L／s，搅拌速度为100—180r／min培养，培养结束后测定细菌生长浓度。结果表明W135群脑膜炎球菌生长繁殖与通气量和搅拌速度关系密切，随着细菌浓度的增大，细菌对O2的需求亦会不断增多，故加大供氧量和搅拌速度可改善W135群脑膜炎球菌生长环境，充分利用培养基中的营养成分并缩短了培养周期，见图7。
7 W135群脑膜炎球菌培养放大工艺的验证
采用以上各优化条件进行500L发酵罐连续培养W135群脑膜炎球菌CNCC(29037)株3批，确证其培养条件的可行性，。通过各时间段取样比浊、镜检细菌形态良好，荚膜丰厚。培养7—8h时细菌浓度增高，荚膜多糖同比条件产量达到最高。结果表明，此培养条件适宜规模化生产。
讨论
通过对脑膜炎球菌发酵工艺的研究表明，W135群脑膜炎球菌生长不仅取决于菌种本身的特性，而且赋以合适的环境才能使其良好的生长。W135群脑膜炎球菌的致病性与许多毒力因子有关，抗原主要成分存在于菌体的表面结构中，细菌的生长状态会直接影响细菌荚膜多糖的产量。从培养基营养成分、pH、接种浓度、温度、培养时间、通气量、搅拌速度的实验比较测试中表明，培养基中补加1％ 的葡萄糖能明显改善细菌对营养因子的利用，使细菌的生长周期持续稳定。培养时间的长、短直接影响细菌总产率。在对数生长期前期收获细菌，可避免细菌白溶酶的释放，对后续去除细菌杂质有利，但收获量不高。而对数生长期后期收获细菌，细菌生长延缓pH值开始回升，易导致菌体各成分和细菌内毒素的释放，从而影响多糖抗原的纯化难度及细菌抗原的有效成分。其次调整接种浓度在2.0—3.0亿／ml和pH控制在6.5—7.5之问及温度在36.5±0.20C都是首选的优化条件。再次通气量和搅拌速度对该菌生长亦起到一定的辅助作用。由于培养后期细菌的黏度及浓度增大，细菌的代谢产物亦会不断增多，因此加大供氧量和搅拌速度可改善W135群脑膜炎球菌生长环境，以利于充分利用培养基中的营养成分并缩短了培养周期。
实验中受国产发酵罐材质等因素的影响，对细菌的其它生长条件未能全面深人的研究。另外关于W135群脑膜炎球菌培养的相关报道较少，可参考的依据有限。因此实验室50L培养罐培养放大到500L培养罐培养难度较大，摸索了大量的工艺参数。根据流脑菌群的生长特性通过小量多批次实验，取得了最佳培养参数。按其参数在500L发酵罐放大量中试培养中也达到满意的结果。通过500L发酵罐连续3批实验的验证，细菌生 长形态及荚膜丰厚度良好，细菌收获浓度均在110亿/ml左右，荚膜多糖含量平均达到12g。为A、C、Y和W135四价多糖疫苗的研制和大规模工业化生产提供了科学的依据。
