果聚糖是自然界中分布最广泛的生物高分子,是以β-2,6-键和β-2,1-键连接的吡喃果糖基组成的多糖。根据连接键的不同,分为2种类型的果聚糖:菊粉和果聚糖[1]。果聚糖及其衍生物在医学、药学、农业、化妆品和食品等工业中具有广泛的应用,具有重要的应用价值[2],对它的研究也引起了国内外众多学者的关注[3]。产果聚糖的微生物主要有Zymomonasmobilis、Erwiniaherbicola、Rahnellaaquatilis,微生物发酵法生产果聚糖的产量一般为3～16ｇ/Ｌ[4～6]。国内外尚未有(纤维单胞菌属Cellulomonas)微生物产生果聚糖的报道。本课题以Cellulomonas sp. GJT07作为发酵菌种,对其发酵生产果聚糖的条件进行了研究。
1 材料和方法
1.1 实验菌株产果聚糖菌株Cellulomonas sp. GJT07,由本实验室分离,由ＣＣＴＣＣ保藏,菌种保藏号为Ｍ205085。
1.2 培养基平板分离培养基及斜面培养基(ｇ/Ｌ):蔗糖20,ＮａＮＯ3 1,Ｋ2ＨＰＯ4 0.5,ＭｇＳＯ4 0.5,ＮＨ4Ｃｌ 0.5,ＦｅＳＯ4 0.01,琼脂15。种子培养基(ｇ/Ｌ):蔗糖20,蛋白胨3,Ｋ2ＨＰＯ4 2,ＮａＮＯ3 1,ＭｇＳＯ4 0.5,ＦｅＳＯ4 0.01,ｐＨ7.5,115℃灭菌25min。初始发酵培养基(ｇ/Ｌ):蔗糖30,蛋白胨5,Ｋ2ＨＰＯ4 2,ＮａＮＯ3 1,ＭｇＳＯ4 0.5,ＦｅＳＯ4 0.01,ｐＨ7.5,115℃灭菌25min。
1.3 培养方法液体种子培养:将活化后的斜面菌苔2环接种于装有50ｍＬ种子培养基的250ｍＬ三角瓶中,30℃,180ｒ/min摇瓶培养20ｈ。发酵培养:将上述培养好的种子液按5%的接种量接入装有100ｍＬ发酵培养基的250ｍＬ三角瓶中,30℃,180ｒ/min摇瓶培养48ｈ。
1.4 分析方法
1.4.1 多糖产量[7]发酵液于4000ｒ/min离心10min去除菌体,在上清液中加入2.5倍体积的95%乙醇,玻璃棒搅动至出现絮状沉淀,4℃保温过夜,4000ｒ/min离心去除上清液,沉淀以蒸馏水复溶,4000ｒ/min离心取上清液,用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。
1.4.2 ｐＨ值采用精密ｐＨ计测定。
1.4.3 细菌数量测定采用平板计数法。
1.4.4 多糖组成分析[8]取多糖20ｍｇ,加入2mol/ＬＨ2ＳＯ42ｍＬ,置安瓿管中,充氮气后封管,90℃反应4ｈ,冷却后以ＢａＣＯ3中和,离心,上清液浓缩备用。浓缩液用纸层析和高效液相色谱仪进行分析。
2 结果与讨论
2.1 发酵培养基的建立与优化
2.1.1 不同碳源的影响与选择首先对发酵培养基的碳源作单因素比较试验。大多数发酵所用的碳源主要是葡萄糖、果糖等单糖,蔗糖、乳糖等二糖,淀粉等,鉴于淀粉为多糖,易与本实验的产物多糖混淆而不利于产物多糖的分离、提取与测定,实验中比较了葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖分别作为碳源时对菌体产糖的影响。
以初发酵培养基为基础,改变不同的碳源,30℃,48ｈ摇瓶发酵,检测其多糖产量。由图1可知,不同碳源对菌株的产糖活力影响较大。当碳源为蔗糖时产糖量最高,达7.34ｇ/Ｌ。
2.1.2 不同氮源对多糖产量的影响以初始发酵培养基为基础,以蔗糖为碳源,改变氮源的种类,30℃,48ｈ摇瓶发酵测定其多糖产量。结果见图2。此菌株利用不同的氮源产多糖差异较大,其中以蛋白胨为有机氮源时多糖产量最高,为10.75ｇ/Ｌ,硫酸铵为无机氮源时多糖产量较高,为5.87ｇ/Ｌ。
2.1.3 混合氮源对产糖的影响由于工业生产中利用无机氮源,将会大大降低培养基的成本,因此将蛋白胨和硫酸铵以不同浓度配比配制培养基,同时考虑菌体的产糖情况,选取两者的最佳配比。结果如表1。当蛋白胨、硫酸铵浓度分别为0.5%、0.1%时,菌株产糖最多,可达11.94ｇ/Ｌ。
2.1.4 发酵培养基的正交优化实验根据营养条件的单因素实验结果,确定正交试验的考察因素及其水平(表2),选取碳源(蔗糖)、氮源〔蛋白胨+(ＮＨ4)2ＳＯ4〕、ＭｇＳＯ4和Ｋ2ＨＰＯ4作4因素3水平的正交实验。正交实验结果表明,4种因素中蔗糖、氮源和Ｋ2ＨＰＯ4对产糖影响极为显著,对多糖产量的影响大小为:蔗糖>氮源>Ｋ2ＨＰＯ4>ＭｇＳＯ4,最优的培养基组成为Ａ3Ｂ3Ｄ2Ｃ1。优化后培养基组成为(ｇ/Ｌ):蔗糖40,蛋白胨7,(ＮＨ4)2ＳＯ4 1.4,Ｋ2ＨＰＯ4 2,ＭｇＳＯ4 0.25,ＦｅＳＯ4 0.01。
2.2 发酵培养条件的优化
2.2.1 培养温度为探讨最适的培养温度,在以上实验的基础上,
用优化后的发酵培养基,分别在24、27、30、33℃摇瓶发酵培养48ｈ后,测定多糖产量。由图3可知该菌株最适产糖温度为30℃,多糖产量高达14.39ｇ/Ｌ。
2.2.2 培养基初始ｐＨ培养基的初始ｐＨ值对发酵微生物的生长及代谢有一定的影响。按优化后的配方配制培养基,高温灭菌后,以0.1mol/Ｌ的ＮａＯＨ或ＨＣｌ调节不同的初始ｐＨ值。接种后,30℃摇瓶发酵48ｈ,实验结果如图4。ｐＨ8 0时产糖量最高,达14.63ｇ/Ｌ。
2.2.3 摇瓶装液量实验中,借助同一型号、规格的三角瓶分装不同体积的液体发酵培养基,即通过装液量的不同来模拟不同通气量对发酵产糖的影响。30℃发酵48ｈ测定多糖产量,由图5可知,当装液量为75ｍＬ时,多糖产量最高,为14.70ｇ/Ｌ。
2.2.4 摇瓶转速摇瓶转速的快慢决定着摇瓶内培养基溶氧量的大小,本试验借助不同的摇瓶转速来模拟不同溶氧量对发酵产糖的影响,30℃发酵48ｈ测定多糖产量。
由图6可知,当摇瓶转速为180ｒ/min时,多糖产量高达14.67ｇ/Ｌ。
2.2.5 接种量将种子分别按4%、6%、8%、10%的接种量接入装有75ｍＬ的250ｍＬ三角瓶中,30℃发酵48ｈ测定多糖产量,试验结果如图7。可知当接种量为6%时菌株的多糖产量最高,达14.32ｇ/Ｌ。
2.3 摇瓶发酵过程动态根据实验结果,按优化后配方配制培养基,装液量75ｍＬ(250ｍＬ三角瓶),经高压灭菌后调初始ｐＨ8.0,接种量6%,30℃摇瓶发酵,定时采样监测发酵过程中ｐＨ值、细菌数量、多糖产量3等项参数,绘制成摇瓶发酵过程曲线图(图8)。
由摇瓶发酵过程曲线可见,菌体生长至30ｈ开始进入稳定期,ｐＨ下降减缓,产物多糖在发酵的前24ｈ合成缓慢,之后合成速度加快,至48ｈ积累达到高峰,产量达到15.27ｇ/Ｌ。在整个发酵过程中,多糖生成量与菌体生物量之间可能具有正相关关系,菌体不再增加,产物合成也趋于缓慢。根据产物多糖积累量峰值对应的时间,可以确定发酵周期应以48ｈ为宜。
2.4 多糖的组成分析将多糖用稀酸水解(1mol/ＬＨ2ＳＯ4,90℃,4ｈ)之后,用ＢａＣＯ3中和水解液,离心,取上清液,通过纸层析和高效液相色谱法进行分析。将上清液点样于新华中速层析滤纸进行纸层析分析,展开剂为Ｖ(正丁醇)∶Ｖ(乙酸)∶Ｖ(水)=4∶1∶5(溶剂层),显色剂为苯胺 二苯胺,标准单糖为葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖。通过纸色谱分析发现,结果显示为单一斑点,其Ｒｆ值以及呈色反应都与果糖标准品一致。又将上清液和果糖标准品经精密的高效液相色谱仪进行分析,色谱柱为ＩｎｅｒｔｓｉｌＮＨ2(4.6×250ｍｍ,5μｍ),流动相为Ｖ(乙腈)∶Ｖ(水)=75∶25,流量为0.8ｍＬ/min,示差检测。结果显示,该多糖水解液色谱峰只含1个主峰,其出峰时间与果糖标准品的出峰时间一致(7.2min),色谱图见图9和图10,表明该多糖水解液中只有果糖。由此证明由Cellulomonas sp. GJT07菌株生产的多糖为果聚糖。
3 讨 论文中以Cellulomonas sp. GJT07为发酵菌种,对其胞外多糖的发酵培养基配方及工艺条件进行了研究,确定了最适的产糖培养基的组成及条件,使菌株产糖能力得到较大水平的提高,实际产量达15ｇ/Ｌ。最适发酵产糖培养基配方为(ｇ/Ｌ):蔗糖40,蛋白胨7,(ＮＨ4)2ＳＯ4 1.4,ＭｇＳＯ4 0.25,Ｋ2ＨＰＯ4 4,ＦｅＳＯ4 0.01,ｐＨ8。摇瓶发酵实验表明,发酵30ｈ菌体生长进入稳定期,48ｈ时达到产糖高峰。多糖的组成分析结果表明,该多糖为果聚糖。纤维单胞菌属产果聚糖的报道在国内外尚属首次。同时,实验表明,该菌种具有营养要求低,容易培养和培养时间短,具有较高的产糖能力,发酵产糖成本低的特点,因此具有一定的工业化开发潜力。为了对菌株Cellulomonas sp. GJT07产的果聚糖有更深的认识,同时为该多糖的工业化发酵生产提供基础研究,该多糖的结构分析和生物活性的深入研究正在进行之中。
