迟东升 阮新民 广州中医药大学第二临床医学院心脏中心
摘要：纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶，与传统的一些溶栓剂相比，其具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血，纤溶活性强，作用时间长等优点，有望被开发为新一代的口服抗血栓药物。现就纳豆激酶的结构、理化性质、药理学作用及机理、分离纯化、活性测定方法以及开发现状和应用前景等方面进行了综述。
血栓和栓塞性疾病严重威胁着人类的生命健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。目前临床上治疗血栓和栓塞主要是通过注射尿激酶（UK）、链激酶（SK）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、乙酰化纤溶酶原链激酶激活剂（APSAC）和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（scu-PA）。这些药物均为纤溶酶原激活剂，通过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。在实际应用中它们都具有一定的局限性，或是毒性比较强，易引起出血，不良反应大；或是在体内半衰期短，且不易被吸收，只能静脉给药，药效难以发挥；或是来源紧缺，成本高，价格昂贵。
纳豆在日本是一种历史悠久的大豆发酵食品，已有1000多年的历史。早在日本江户时代，纳豆就作为一种健康食品，可用来治疗风邪、醒酒，也用来预防和治疗心脑血管疾病。现代研究认为，纳豆具有抗血栓、降血压、抗菌、抗氧化、预防癌症等多种生理调节功能，此外，它兼有减轻疲劳，治疗脚气病的功效，每天坚持服用200g纳豆就可以预防脑血管意外的发生。纳豆的传统制法与中国的豆豉会被一种粘稠状的聚合物所覆盖，这种粘稠状的物质能拉长长丝，其独特的味道是由一种特殊品系的枯草杆菌——纳豆芽孢杆菌发酵作用产生的。而各种有效成分中最受瞩目的是具有溶血栓作用的纳豆激酶。文献报道显示，纳豆中除了纳豆激酶外，还存在尿激酶、弹性蛋白酶以及尿激酶原激活剂等，这可能是由于菌株和生产工艺的不同造成的。
1987年，sumi等首次报道在纳豆中存在一种具有强烈纤溶活性的酶——纳豆激酶（NK）。研究表明，NK是一种丝氨酸蛋白酶，是由纳豆菌产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶，能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂，从而更有效地发挥溶栓效果。试验研究证实该酶不仅易于提取纯化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用，因此有望成为一种新型溶栓药物。
1 纳豆激酶的结构——纳豆激酶的核苷酸序列
Nakamua等于1992年用鸟枪法首先在大肠杆菌宿主载体系统中克隆得到了包括调控序列在内的NK基因（又称枯草杆菌蛋白酶NAT基因，aprN）的全长序列。该基因长1473bp，以GTG为起始密码子，其上游-17bp至-11bp位点为核糖体结合位点S-D序列：AAAGAG。S-D序列上游是A/T含量高达72%的转录调控区，但在此区尚未找到与已知枯草杆菌蛋白酶启动子相类似的保守序列。起始密码者利用PCR技术从分泌纳豆酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到了NK基因，利用基因重组技术构建了NK基因的表达载体，在大肠杆菌中实现了表达；刘北域等则在大肠杆菌中表达NK原基因，并使NK基因在芽孢杆菌中进行了表达。
2 纳豆激酶的理化特性
2.1分子量和等电点
NK为白色粉末状、无臭味。现由分离纯化的NK基因DNA序列推出其氨基酸序列，根据该顺序计算出该酶的准确分子量为27728D（≈27.73×10的3次方），远小于尿激酶的分子量54000D。用Svun-sson柱型电泳法等电聚焦测得NK具有对称的单一的纤溶酶峰，其PI值为（8.6±0.3）。
2.2理化性质
在pH6.0-12.0情况下，NK比较稳定，PH低于5.0时，则很不稳定。40℃保温30min，酶活无损失，温度超过50℃时，活力逐渐丧失，超过60℃时，则因蛋白变性而迅速失活。研究表明，冻融对NK活性影响不大，反复冻融5个循环，酶活性仍保持95%以上。若添加明胶，可使其热稳定性提高5倍以上。当NK与煮沸过的小麦或大米提取液、肉汤以及血清蛋白和胃粘液蛋白混合后，NK的稳定性显著提高，甚至在酸性条件下，仍保持有酶活性,说明NK在胃环境中能保持一定的活性，因此可口服来达到溶栓目的。NK的活性不受5mmmol/L半胱氨酸的影响，但1mmmol/L二异丙基氟代磷酸酯（DFP）和5mmmol/L敌百虫和5mmmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)则能完全抑制该酶活性，由此可推测该酶的活性中心是丝氨酸结构。它的活性受金属离子影响，CU、ZN和AI等金属离子对NK有明显的抑制作用，Hg可使其完全失活，而Mg和Co对该酶则有显著的激活作用。此外，NK可与血浆a巨球蛋白按摩尔比2：1结合而失去活性。添加甘油、丙二醇、牛血清蛋白和海藻酸钠等有利于提高酶的热稳定性。
2.3 底物特异性
Sumi等通过对几种人工合成的小分子短肽作为反应底物，研究该酶的酰胺水解活性，发现NK最敏感的底物是血浆纤维蛋白溶酶也有一定活性，而对尿激酶底物和弹性蛋白酶底物则无明显活性。这说明NK有其特异的蛋白水解作用和识别位点。另有报道，NK对枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶的底物也有高度水解活性。
3 纳豆激酶的实验和临床研究
NK是目前发现的近200种具有口服溶纤作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白酶，用纤维蛋白板测定NK活性，结果显示，1g纳豆中提取的NK活性相当于40CU纤溶酶或1600U尿激酶单位，具有很高的经济价值。通过动物血栓模型研究NK的溶栓活性，发现NK不仅有很强的溶栓作用，同时还可抑制血栓的形成，并在一定范围内呈量效关系。体外研究显示NK能够剂量依赖性地降低红细胞聚集性和血液低切性粘度。另据报道，NK中含有血管紧张素转换酶抑制剂的成分，这种抑制剂具有抗高血压和心力衰竭作用，因此可以进一步NK在治疗高血压和心力衰竭方面的应用。
3.1纳豆激酶的体外溶栓实验
NK的体外溶栓作用十分明显，最早就是因为其具有限制体外溶栓效果而被发现的。NK可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸，当酶提取液滴加到纤维蛋白平板上，即出现透明的溶解圈，酶活性越大，溶解圈越大。王萍等发现NK粗酶体外溶栓作用显著，高剂量和低剂量作用凝血块6h后，溶解率分别为88%和74%，蚓激酶为87%。
3.2纳豆激酶的体内溶栓实验
3．2．1用纤维蛋白平板法和溶解时间标准曲线法测定，在以大鼠为对象的动物实验中通过静脉注射发现NK的纤溶能力是血纤维蛋白溶酶的4倍以上。在小鼠十二指肠内给药，3～5h即可检测出NK并产生纤溶效果；对兔血栓模型也有明显的溶栓作用。
3.2.2以大鼠为实验动物，研究发现NK可由消化道吸收到血液中而起到纤溶作用，而且NK在发生纤溶作用时，不是激活纤溶酶原，而是直接作用于交联纤维蛋白。NK对交联纤维蛋白水解活性很强，但对纤维蛋白原却不敏感，提示NK在发现纤溶作用时，不水解血浆纤维蛋白原，不易引起出血倾向。
3.2.3从狗的股大静脉注入血清纤维蛋白原和牛凝血酶，使其形成体内静脉血栓，实验组的狗服用4粒NK胶囊（250mg/粒），对照组则服用煮熟大豆，测定h狗血浆的纤溶活性，并通过血管造影术观察血栓溶解情况，试验表明，对照组狗在服用熟大豆18h后，仍无溶栓现象，而实验组狗5h后血栓即完全溶解，血液循环完全恢复。
3.2.4 在小鼠颈总动脉中注射醋酸造成内皮细胞损伤生成血栓，分别静脉注射等摩尔数的NK、纤溶酶和弹性蛋白酶，测定血流再通率和纤维蛋白残留率，观察体内溶栓活性。1h后血流的再通率分别是（62.0±5.3）%，（15.8±4.5）%和0%，说明NK的体内溶栓效果远远大于纤溶酶和弹性蛋白酶。
3.2.5 NK可剂量依赖性的对抗小鼠体内血栓形成。试验显示对照组小鼠静注血栓诱导剂后，15min内血流恢复率为0，阿司匹林阳性对照组和NK高剂量组血流恢复率为100%，而NK中、低剂量组的恢复率分别为60%和20%。NK15000、7500、3750U/kg均能显著延长小鼠凝血时间（CT）。NK2500U/kg和5000U/kg能显著延长兔血液凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT），显著降低兔血液纤维蛋白原（FIB）含量；5000U/kg还能显著延长凝血酶时间（TT）。
3.2.6 王俊菌等的研究结果发现固体粉末NK的活性为565510U/g,是尿激酶的3.13倍；液体NK的活性为15324U/ml；NK能显著延长家兔全血凝固时间、血浆复钙时间、凝血酶时间、大鼠凝血活酶时间、凝血酶引起的纤维蛋白凝固时间、大鼠凝血酶原时间。NK对凝血过程的3阶段都有影响。
3.3 纳豆激酶的调脂作用
研究表明纳豆粗提物可降低血脂水平，通过升高高密度脂蛋白胆固醇、降低低密度脂蛋白胆固醇调节脂质代谢、具有抗脂质过氧化作用，在预防动脉粥样硬化形成过程中发挥作用。段智变等用高脂饲料建立试验性高血脂症兔模型，模型建立第8周时，纳豆粗提物组血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、丙二醛、动脉粥样硬化指数（AI）分别比模型组降低了39.88%、44.54%、48.84%、48.25%、70.20%，而HDL-C、超氧化物歧化酶含量分别提高了75.81%、38.32%。袁淑云的研究也取得了类似的结果。
3.4 纳豆激酶的抗动脉粥样硬化作用
Suzuki等在大鼠血管内皮损伤前3周开始给予纳豆提取物（含NK），血管内皮损伤或继续给予3周，3周后纳豆提取物组的内膜/中层厚度比值较对照组明显减少{（0.06±0.01）vs（0.15±0.03），P小于0.05
3.5 纳豆激酶的保护心肌缺血作用
李欣志等给Beagle犬重组NK1周后发现血小板计数下降，PT明显延长，Fib含量明显降低，纤溶酶原活性升高。NK能促使猪冠脉血栓溶解，显著缩小血栓面积，促进血管的再通；同时可明显减轻心肌缺血程度，缩小心肌梗死面积，降低心肌梗死动物血清中新机型肌酸激酶同工酶活性。
3．6 纳豆激酶的临床应用
实验表明健康人服用NK可明显缩短优球蛋白的溶解时间，促进纤溶活性，作用时间可维持2～8h，大大长于目前临床上使用的溶栓药物。健康人口服NK后1～8d，血浆优球蛋白纤溶活性逐渐升高，在第8天达到峰值，同时伴随血浆纤维蛋白降解产物增高，表明纤维蛋白迅速溶解。
4 纳豆激酶溶栓作用机理
大多数溶栓药物，如链激酶、尿激酶、t-PA等都是纤溶酶原激活剂型，均需通过激活靶酶，即纤维蛋白溶酶原转变为纤维蛋白溶酶，再与纤维蛋白结合，发生溶栓作用，而其自身不能直接作用于纤维蛋白。NK则不然，它对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感，可直接将其水解成小肽和氨基酸。当把酶提取液滴加到纤维蛋白平板上，短时间内即可出现透明的溶解圈，体外溶栓效果显著。此外，将NK应用于狗的血栓模型实验及健康人群的体内研究，表明其不仅可以抑制血栓的形成，还可迅速降解纤维蛋白，增加FDP的量，明显缩短血浆中的优球蛋白的溶解时间，并能降低纤溶酶原激活剂抑制因子的活性，从而激活静脉内皮细胞，引起t-PA的继发性增加，同时激活尿激酶原（UK）转变为尿激酶，使内源性纤溶酶的量和活性间接增强。因此，NK的作用机理可能为：（1）刺激血管内皮细胞产生t-PA,t-PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白、降解血栓；（2）将体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-PA共同激活纤溶酶原，溶解血栓；（3）降解和失活尿激酶和t-PA的抑制剂PAI-1，进一步激活更多的尿激酶和t-PA，促进血纤维蛋白的溶解；（4）NK本身是一种丝氨酸蛋白酶，具有直接水解交联纤维蛋白的作用。研究表明，NK溶栓效果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶，活性是纤溶酶的4倍。Fujita等给大鼠十二指肠灌注NK，利用抗纤维蛋白原λ链抗体和抗NK抗体经westernblot分析发现，肠道内的NK纤维蛋白原复合物，并经270000U、200000U中间体把纤维蛋白原最终降解成105000U的片段。NK对交联纤维蛋白有很强的水解活性，但对纤维蛋白原却并不敏感。试验证明，NK的纤维蛋白原水解活性远低于纤溶酶和弹性蛋白酶，甚至尿激酶，而与t-PA基本相同。提升NK在发挥纤溶作用的同时，不水解血浆纤维蛋白原，不易引起出血倾向。
5 纳豆激酶的分离纯化
NK是胞外酶，故可利用纳豆菌的发酵液提取。方法如下：将纳豆菌的发酵液离心，取上清液，用硫酸铵或乙醇沉淀，再经离心以除去发酵上清液中测粘性物质，主要是果糖和多聚谷氨酸。离心后取沉淀，溶于换成液中便为粗酶液。粗酶液经过超滤脱盐，离子交换，柱层析，透析，最后冷冻干燥即得酶干粉。若以纳豆为材料提取NK，只需在上述步骤前增加一步，先用生理盐水浸提，其它相同。高大海等用层析方法纯化一种与NK性质相似的枯草杆菌纤溶酶，最终纯化倍数和酶活力回收率分别为8.4%和49%；而郝淑风等采用2B和sephacrylS-200助层析对另一种枯草杆菌溶纤酶进行分离纯化，所得产品纯化倍数为30倍，活力回收率为40%，酶活力1.68×105U/mg。
6 纳豆激酶的开发现状及应用前景
NK在日本已得到广泛深入的研究，其制剂NKCP等已面市。美国国际医卫生技术制药股份有限公司的NK胶囊也已面市。在我国，NK制剂-恩开胶囊也已进入中试阶段。近年，齐海萍等和Kim等分别从韩国、中国的传统发酵食品、豆豉中分离到了产生具有纤溶性酶的枯草芽孢杆菌。
目前应用的溶栓药物如尿激酶、链激酶等在人体内的半衰期过短，只有3-20min,要使其达到应有的疗效，必须大剂量长期用药，容易产生全身性出血的倾向。而NK可以很好地弥补这些缺陷，它分子量小，无免疫原性，安全无毒，药效高，作用时间长，在体内的半衰期可达8h,不仅能抑制血栓形成，而且溶栓作用强，并能抗胰酶水解，在肠道内稳定性好，易被人体消化吸收，因而既可以静脉给药，也可以口服。NK可以采用细菌发酵进行规模生产，周期短，产量高，且易于提取纯化，成本低廉。这些独特的优点无疑将使其成为新一代理想的预防和治疗血栓和栓塞性疾病的有效药物。
