2012年第3期（总第160期)
刁建中1，陈桂光2，3，马波2，李文杰2（1.南宁新技术创业者中心，广西 南宁 530004；2.广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004；3.广西南宁智天生物科技有限公司，广西 南宁 530004）
【摘 要】 纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有特殊的溶血栓活性，其安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、半衰期长、生产价格低廉，是一种理想的溶栓剂。根据已有文献报道，综述了纳豆激酶的生化性质、溶栓机制、活性检测方法、研究现状和应用前景，并对其作为一种新型溶栓剂进行了展望。
【关键词】 纳豆激酶；血栓；生化性质；溶栓机制；酶活测定
纳豆是日本的一种具有1000多年历史的传统营养食品，源于我国历史更悠久的发酵食品豆豉。1986年，日本的须见洋行教授考察了173种食品，发现只有纳豆可以溶解血栓[1]。血栓疾病是一种常见疾病，其致死率较高，市场上对预防和治疗血栓性疾病药物的需求量逐年增加。纳豆激酶在所有的纤溶酶类产品中研究最早，目前也是开发最多的溶栓剂产品。国内外对纳豆激酶已有二十多年的研究，其理化性质、溶栓机制、分离纯化等已被人们所了解，纳豆激酶类药品及保健食品的研究正在进行当中。
1. 纳豆激酶生化性质
1980年须见教授[2]在美国芝加哥大学进行血栓溶解酶pro-UK与UK的构造分析研究时，无意间发现纳豆食品中含有高浓度的血栓溶解成分，纳豆食品在发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶（serine proteinase），将其命名为纳豆激酶，经纯化后发现，其等电点为8.6±0.3，分子量为27,728，是由275个氨基酸构成的单链多肽结构。在pH值6.0~12.0的范围内具有很强的血纤维蛋白溶解能力，40℃保温30min活力无变化，温度超过50℃活力逐渐丧失，超过60℃时，酶活急速下降，但反复冻融对酶活影响不大，当与血清蛋白、胃黏液蛋白以及煮沸过的小麦和大米提取液和肉汤混合后，纳豆激酶的稳定性显著增加，甚至在酸性条件下，酶活也只部分丧失，说明纳豆激酶在胃环境中能保持一定活性。江晓[3]等研究发现，K+、Fe2+对酶活稳定性无明显影响，而Zn2+、A13+、Ca2+和Mn2+等则表现出不同程度的抑制作用，Hg2+可使纳豆激酶完全失活，Mg2+和Co2+对酶有明显的激活作用。
2. 纳豆激酶溶解血栓机制
2.1 纳豆激酶的直接溶栓作用
1987年须见洋行博士发现纳豆中含纳豆激酶后，经研究发现纳豆激酶具有水解纤维蛋白的作用，它具有严格的限制性酶切位点，可直接作用于交联纤维蛋白，使其水解成可溶性的小分子，从而达到直接溶解血栓的作用。Fujita[4]等利用提取纯化的纳豆激酶，与交联的纤维蛋白进行酶解反应，通过提取不同时间的酶反应样品，在还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现纳豆激酶在不同时间降解交联纤维蛋白的片段的大小不同，随着反应时间的延长，其降解产物中出现1413kD、36kD和41kD等不同大小的片段，从而表明纳豆激酶具有直接降解血栓的作用。
2.2 纳豆激酶激活体内尿激酶原转为尿激酶
须见洋行[2]等研究发现，纳豆激酶可激活体内尿激酶原转变为尿激酶，而尿激酶能激活纤溶酶原产生纤溶酶，增加内源纤溶酶，从而增加体内溶栓作用。Nakanishi K[5]等研究发现，纳豆激酶也可激活体内尿激酶原转变为尿激酶，水解四肽的纤溶酶底物，使纤溶酶原激活，从而增加纤溶酶活性，进一步加强它的溶栓作用。
2.3 纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生内源t-PA
纳豆激酶可促进血管内皮细胞产生内源t-PA ，t-PA催化纤溶酶原转变成纤溶酶，以使积累的纤维蛋白或血栓溶解。组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)可激活体内的纤溶酶原，形成纤溶酶，同时t-PA的活性又受到纤溶酶激活剂的抑制剂(pAI-1)的抑制，调控纤溶酶的作用以保证体内纤溶系统的正常机能。Yoshikazu Yuki[6]等研究发现当人口服纳豆激酶之后，用ELSA检测法测定不同时间内血液中t-PA含量的变化。测定结果表明，口服纳豆激酶4h 后，血液中 t-PA 的含量可增加到10ng/ml 以上，而正常情况下，人体内t-PA的含量约为6～7ng/ml。从而表明口服纳豆激酶被吸收到血液中后，刺激血管内皮细胞产生内源t-PA，促进血液中t-PA含量的增加，而t-PA可激活纤溶酶原产生新的纤溶酶，溶解血栓。
2.4 纳豆激酶通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂（PAI-1）调控纤溶作用
近几年日本学者又发现纳豆激酶在体外具有降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂（PAI-1）调控纤溶作用。纤溶酶原激活剂主要通过降解t-PA来调节纤溶酶原被激活为纤溶酶，纳豆激酶降解和失活重组PAI-1的作用位点是在rpPAI-1的Arg346-Met347氨基酸残基之间，该位点正处于它的酶活性位点（PI-PI’）附近，从而破坏了rpPAI-1的作用位点，使其失去活性。利用纳豆激酶溶解富含PAI-1的纤维蛋白过程中，rpPAI失活，t-PA不被降解，纤溶酶增多，溶解时间变短。
3. 纳豆激酶的酶活性检测方法
3.1 纤维蛋白平板法[7]
该方法是由Astrup于1952年建立，其原理是凝血酶能将纤维蛋白原水解成纤维蛋白，生成由交联纤维蛋白组成的人工血栓平板，溶栓剂的酶活与透明圈面积的对数成一定的线性关系。以尿激酶等标准样品绘制标准曲线为基准，可以直接根据标准曲线计算出纳豆激酶的酶活。使用该方法测定酶活时，如果恒温孵育时间变化，测定的酶活也会变化，恒温时间延长，测定值会显著降低，并且测定过程中要严格控制恒温温度和恒温时间，该方法是最为直观的酶活测定方法。
3.2 纤维蛋白块溶解法[8]
此法简称CLT法，纤溶酶、t-PA、UK等溶血栓物质都采用此法测定酶活。以标准尿激酶单位为基础，测定不同活力单位尿激酶对一定量纤维蛋白的溶解时间，以酶活单位对溶解时间作图，得出标准曲线。根据所测NK的溶解时间，即可利用标准曲线计算其酶活，该方法具有较大的分辨率，测定时间短，但由于需要精确判断反应时间，所以不太适合灵敏度要求较高的样品的活性测定，同时难以测量多个样品的酶活。
3.3 四肽底物法[9]
研究表明，纳豆激酶与枯草芽孢杆菌蛋白酶E有高达99.5%的同源性，二者的催化中
心和结合中心相同，只有两个氨基酸不同。因此有人用测定枯草芽孢杆菌蛋白酶E的方法，四肽底物法来测定NK的活力。酶活力单位的定义为：1min内水解四肽底物Suc-Ala-Pro-Phe-PNA时生成一微升硝基苯胺的酶量为一个单位。杨明俊等[10]从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较，验证了两种方法测定值之间有很好的直线相关性(R2=0.9942)。虽然该方法简便、灵敏度高，适用于纳豆激酶的快速测定及发酵工艺、分离纯化等需要高通量筛选的分析，但是能不能完全反应溶栓剂的纤溶活性有待进一步研究。
3.4 血清板法[11]
血清板法是纤维平板法的改进。其原理是，纤维蛋白形成初始，在655nm处的吸光度最大，随着NK的加入，使纤维蛋白溶解，吸光度逐渐下降。试验发现，吸光度的减少同NK的浓度成线性关系。该方法的优点是可以同时检测多个样品，而且在4h内即可对酶活进行测定，操作简便、快捷，耗材少，成本低；-ΔOD655值的变异系数CV%在5%之内，可信度高。
3.5 酶联免疫吸附法(ELISA)[12]
该方法是Yuki等研究纳豆激酶时建立的，灵敏度高达0.1ug/L，具有极高的特异性，其原理利用NK有特异性的单克隆抗体与NK发生特异结合，然后同连有标志酶的多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过对标志酶—过氧化物酶的反应测定NK的活性。该方法具有灵敏度高，抗干扰性及特异性强等优点，但其成本十分昂贵，操作复杂，因此实际应用受到限制。
4. 纳豆激酶的开发现状和应用前景
目前，国内外在抗血栓药物方面的研究，正趋向于低价高效、易吸收、体内半衰期长的药物方向发展。纳豆激酶是目前发现的近200多种具有口服溶纤作用的药物中最具潜力的纤溶蛋白酶。
近年纳豆激酶作为功能性食品、食品添加剂和普通食品发展的十分迅速。仅美国和欧洲的营养品和功能性食品的市场销售额就达5000亿美元，而且以17-20%的增长率逐年增加。日本大和制药有限公司开发出纳豆激酶制品；韩国维寿酶公司，生产的以纳豆激酶为主要成分的维寿酶，为肠溶胶囊；朝鲜人民民主共和国医学科学院推出的新产品“血宫不老精”，为纳豆激酶制品，能有效地溶解血液中的血栓。美国学者也对纳豆激酶的应用进行了研究，心肺血管病专家Martin和Konhei两位博士说，纳豆和纳豆激酶是新开发出用于预防和治疗心肺血管及其相关疾病最有效的溶栓剂，且安全、无毒副作用。国内有北京燕京中发的燕京牌纳豆、北京龙兴的NK胶囊、天津百德公司的纳豆口嚼片、湖南贵生坊的纳豆素胶囊等。
5展望
纳豆激酶因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓塞性疾病，与其它溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可以口服、半衰期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代理想的预防和治疗栓塞的新型药物。将为解决目前血栓溶解药物口服性差、价格昂贵、并发症多等问题带来更多希望。
参考文献
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[5] Sumi H, Hamada H, Nakanishi K,et al. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase [J].Acta Haematol, 1990,84 (1):139-143.
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[10] 杨明俊,杨晓彤,冯慧琴.食品研究与开发,2008, 29 (2) : 137-141.
[11] 谢秋玲,郭勇,林剑.纳豆激酶活性测定方法[J].广东药学,2000,10(6):8-10.
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