研究员 研发部部长
无论是基因工程菌E.coli，还是用于生产传统疫苗所相对应的各类生产菌种，其生长发育过程一般可分为停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期四个阶段，如图9-2-2所示。当细菌被接种至无菌培养基后，需要有一段时间来适应新的培养条件，这一阶段为停滞期（0→a）。在此期间，细菌的代谢旺盛，单个细胞的体积和质量显著增加，但细菌数量不会增多，这一时期的细菌对理化因素极为敏感，抵抗力很弱，停滞期的长短取决于接种细菌的菌龄以及细菌对新环境的适应状况。当细菌适应了新的环境条件以后，就开始生长繁殖进而转入对数生长期（a→b），此期细菌的化学组成和生理学性质稳定，代谢极其旺盛，生长速度迅速增加，细菌数目呈对数增长。当细菌培养接近对数期终点时，由于营养物质的大量消耗以及抑制性代谢产物的不断累积，细菌的生长速率开始下降进入稳定期（b→C），稳定期内的细菌生长速率和死亡速率达到一个动态平衡，因此细菌的数量达到最高峰并得以维持恒定，稳定期的长短取决于细菌的遗传特性及生长条件。当培养基的能量全部耗尽，影响菌体代谢的毒性物质也大量累积，造成细菌死亡速率的迅速增加，细菌步入衰退期（C→d），此时就可以收集菌体或培养液了。
图： 细菌的典型生长曲线
为最大限度的获得发酵产物，即达到菌体的高密度发酵，应赋予菌体生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的比生长速率，适宜的溶解氧以及营养物质的合理流加等。
（1）培养基的选择培养基是细菌赖以生存的环境条件，培养基的组成对菌体的生长繁殖、目的产物的表达、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重大影响，因此选择合适的培养基至关重要。一般应考虑以下因素：营养物质的组成合理、丰富，浓度适当；在一定条件下，所用的各种原材料彼此之间不会产生化学反应，理化性质相对稳定；粘度适中，有合适的渗透压；生产过程中既不影响通气与搅拌的效果，又不影响产物的分离精制和废物处理；尽量做到质优价廉，成本低。
在这些因素中，特别要注意营养物质的浓度和配比适当，过量的营养物质反而会抑制菌体的生长，特别是碳源和氮源的比例，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体的提前衰老自溶；碳氮比过大，不利于菌体的繁殖及产物的积累；碳氮比虽然适中，但相对浓度均过高时，起始菌体可以大量繁殖，发酵后期则菌体生长缓慢，代谢废物过多，容易引起菌体的异常代谢，影响产物的合成；碳氮比适中但浓度过低，会影响菌体的繁殖。
（2）发酵方式的选择按照培养方式的不同，细菌的发酵可分为两种方式：表面培养法和深层培养法。
① 表面培养法。将菌种接种到已灭菌的液体（或半固体或固体）培养基上，在一定温度下进行静止培养，多用于传统疫苗的制备，适合表面培养的菌为需氧菌。在很多情况下，经过一段时间的培养，菌体在培养基表面形成一层菌膜，然后通过收集菌体，经过一系列的后处理过程，制成所需的纯化疫苗。产量的高低取决于培养基的厚度和表面积之间的比例，比表面积越大，培养基越薄，在一定限度内形成的产物也越多。该法具有简单易行、投资省、适合于小型生产等优点，但由于细菌生长在培养基表面，培养基中的营养物质要靠分子扩散达到表面才能被细菌利用，培养后期往往出现营养不足，此外还具有劳动强度大、占地面积大、产量低、易污染等缺点，因而限制了其应用，已逐步被深层培养法所取代。目前我国仍应用该法生产伤寒全菌体灭活疫苗、百日咳灭活疫苗、卡介苗、布氏菌疫苗等。
② 深层培养法（深层发酵）。是指细菌在液体培养基深层进行厌氧和需氧的纯种培养方法。按供气方式的不同，需氧深层发酵可分为两种方式：振荡培养和深层通气培养。振荡培养就是通常所说的摇瓶培养，培养所需的氧气通过培养液在振荡时与外界空气进行自然交换所提供，由于条件的限制，通常只限于实验室培养阶段；深层通气培养是指在纯种条件下，强制通入无菌空气到密闭的发酵罐中进行搅拌培养的方式，由于该法具有生产效率高、占地少、可人为控制等优点，已在疫苗生产中得到越来越广泛的应用。
a. 深层发酵的最优化控制。不同的菌种有不同的生长条件，实现发酵过程的最优化控制，可以最大限度地获得发酵产物，从工程水平来说，发酵过程的最优化控制包括了对接种量、最适温度、pH、溶解氧、搅拌条件的控制以及营养物质的流加等方面。
接种量通常是指移入的种子液体积和培养液体积的比例，接种量的大小决定生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。采用大的接种量，可使生产菌繁殖迅速，很快进入对数生长期，快速占领整个培养环境，减少污染的机会，但过高的菌量往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，从而抑制后期菌体的生长，因此接种量要合适。对于E.coli来说，一般适宜的接种量不宜超过5%。
温度是决定发酵成败的关键因素，细菌的最适生长温度一般在20-40℃之间，温度过低，细菌生长缓慢、代谢微弱，温度过高则会使其死亡。此外温度还会对发酵液的物理性质产生影响，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率等等。因此，在发酵过程中，必须根据不同的菌种选择不同的发酵温度。
绝大多数细菌生长的最佳pH范围在5.5-8.5之间，但在发酵罐中生长代谢的菌体无时不在将其代谢产物释放到培养液中，导致整个系统pH发生较大的变动，因此在发酵过程中，必须要用酸碱来调节培养液的pH，使其维持在一个相对稳定的范围内，有利于细菌的生长代谢，但要注意加入的酸碱需快速扩散至整个容器，避免局部过量的酸碱对菌体造成危害。
溶解氧也是需氧发酵控制的最重要参数之一。对于需氧菌来说，其所需的最低溶氧浓度一般在0.003-0.05mol/L之间，由于氧在水中的溶解度很小，所以必须以无菌空气的形式不断补充，并通过不断的搅拌，增加其溶解度。由于发酵液的摄氧量是随菌浓增加而按比例增加，且氧的传递速率随菌浓的对数关系而减少，因此还可通过控制菌的比生长速率来控制溶氧水平。
搅拌可使发酵罐内的物料充分混合，有利于营养物和氧的传递，并可促进热量的散发以及降低有毒代谢物的局部浓度，从某种意义上来说，搅拌效果越佳，细菌发酵越理想。但同时也要考虑到过大的搅拌速度会向培养液中散发大量的机械热，从而提高了发酵的能耗，且产生的剪切力会损伤到菌体，因此在提供最佳混合效率、避免细胞损伤及降低能耗产量比之间搅拌转速必须达到最优化平衡。此外，在发酵液中，由于通气和搅拌会产生泡沫，如果气泡的体积过大，会影响氧的传递速率并影响到细菌的最佳生长，可适当采用消泡剂来消除泡沫。
此外，营养物质的流加尤其应给予重视。在细菌的发酵过程中，营养物质随着细菌的生长而被消耗，因此需要在培养过程中间歇或连续地补加营养物质才能保证细菌的生长代谢，如一次性添加过多，可能造成发酵初期菌体大量繁殖，致使后期代谢废物积累过多，影响菌体的生长。例如葡萄糖作为常用的碳源在细菌发酵中广泛应用，如其浓度过高，产生的代谢产物乳酸对细菌生长有抑制作用，并且降低了培养液的pH，使溶氧迅速下降；如果葡萄糖的浓度过低，则细菌利用氮源中的碳作为碳源供能，产生氨离子，使培养液pH上升。因此需要对这些限制性基质采取合理流加措施，既满足细菌的生长代谢要求，又尽可能使有害的代谢废物不至积累。常用的补料策略有恒速流加补料、变速补料和指数流加补料等。在恒速流加培养中，限制性基质以恒定的速率流加，相对于整个发酵罐的菌体来说，营养浓度是逐渐降低的，菌体的比生长速率也是缓慢下降，但总的菌量在培养过程中呈线性增加；而变速补料则可以在菌体密度较高的情况下加入更多的营养物质来促进其生长，在整个培养过程中，流加速率可以梯度、阶段、线性等方式不断增加，细菌的比生长速率也不断改变；指数流加补料是一个简单有效的方法，限制性基质的流加速率呈指数增长，从而使发酵罐中的基质浓度控制在较低的水平，减少了乙酸等有害代谢物的生成，菌体以一定的比生长速率呈指数生长，还可通过控制流加的速率来控制菌体的生长速率。以上三种方式为非反馈补料，此外还可根据细菌代谢反馈出的信息控制补料，称为反馈补料，如根据pH的变化调节限制性基质流加速率的恒pH法；以溶解氧为反馈指标调节流加速率的恒溶解氧法；以菌体浓度为反馈指标的菌体浓度反馈法；通过检测CO2 的释放率（CER）来估计碳源的利用情况，从而控制碳源流加的CER法以及通过对溶解氧、搅拌速率、通气和补料速率等的综合控制来维持恒定溶解氧的平衡DO-stat法等等。
b. 细菌的分批培养和连续培养。上述发酵控制主要是针对分批培养，分批培养为一封闭系统，细菌在适宜的条件下历经停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期，终因营养物质的耗尽、毒性产物的积累等原因而归于死亡。连续培养与此不同，为一开放系统，在此系统中，通过连续流加新鲜培养液并以同样速率连续排出发酵液可使细菌由停滞期进入对数生长期并长期保持这一恒定状态，在此期间，细菌的生长速率及其他特性都保持不变。连续培养所用的培养装置包括恒化器（chemostat）和恒浊器（turbidostat）两种，前者通过控制限制性基质的流加速率来控制菌体的生长密度和生长速率，后者通过控制限制性基质的流量来达到维持菌体密度的目的。
分批培养和连续培养都适用于大规模生产，但前者生产效率低、工效差、费工费时，所用容器体积大、数量多，占用空间大，而连续培养则可以弥补这些缺点，但也因为具有投资成本高、发酵周期长（一个周期500-1000h）、易染菌、易突变等缺陷而限制了其发展，目前仅用于一些开发性研究中。
c. 细菌发酵的安全性问题。细菌特别是基因工程重组菌的培养，要特别注意到培养过程中可能发生的变异及泄漏，各国均制定了相关的安全措施，包括了物理密封及生物学密封。
物理密封是指从物理学的角度对发酵过程进行安全控制的一种防护方法，美国NIH按可能逸出生物危害的发生率高低，将物理密封分为BL1、BL2、BL3和BL4级，其中BL4要求最严格，细菌的发酵至少应满足BL1规定，即在发酵过程中对可能发生菌体外泄的部分和操作如：排气、机械密封、取样、培养后的灭菌、接种、放罐等均应采取有效措施以防止菌体外泄。以美国NIH对大规模发酵的物理防范要求为例，包括了培养物在移出密闭系统前有效的程序灭活，在密闭系统中收集样品、添加材料，排出的气体在离开密闭系统前用滤器消毒，为维修或其他目的而打开前用有效的程序消毒，处理大泄露的应急计划和操作程序，旋转密封和其他机械装置不泄露活生物体，完整性评价程序、监测器和传感器等方面的具体要求。
生物学密封则是从生物学角度建立的一种特殊安全防护方法，要求利用一些经过基因改造的有机体作为宿主——载体系统，使之只有在特殊培养条件下才能生存，即使不慎漏出物理密封的屏障，也不可能在实验室外生存，从而达到控制的目的，按密封程度可分为一级生物控制的HV1和二级生物控制的HV2两个类别，HV2要求较严。
物理密封和生物学密封应该相互补充、相辅相成，通过不同方式的组合，达到不同生物安全等级的要求。
