研究员 研发部部长
发酵（fermentation）一词最早来源于拉丁语fervere，意为发泡，指酵母作用于果汁或发芽谷物时产生二氧化碳（CO2）的现象，本质是生物为获得能量前进行的氧化—还原反应。现代生物学的发展拓展了发酵的定义，应用于生物制品学，就是指培养生物细胞（包括真核和原核细胞）获得产物的过程。现代发酵工业由于具有设备占地面积小，生产规模大；发酵速度快，生产效率高；生产机械化，易于自动控制；发酵设备密闭，传热、传质性能良好，不易染菌；副产物少，有利于产物提取等优点而广泛应用于疫苗制品行业。
图1：典型发酵过程的基本示意图
［引自：熊宗贵主编 发酵工艺原理 中国医药科技出版社，2000］
传统疫苗可通过大规模的细胞（细菌）培养（亦即菌体发酵）来制备，而对于基因工程疫苗来说，通常是将能编码某种特定病原体抗原或抗原表位的DNA片段插入一适当的表达载体（多为质粒载体），然后通过转化或转染入宿主细胞，使之在宿主细胞内表达，再通过一系列的下游分离纯化过程获得所需的产物。图1为一个典型发酵过程的基本示意图，在这一过程中，选择合适的表达系统（包括表达载体和宿主细胞的选择）是目的产物获得高效表达的前提，而优化培养工艺、使宿主细胞处于良好的生长状态、达到高密度发酵则是目的产物获得高效表达的关键。
目标产物表达系统的类型
影响目的基因能否在宿主细胞中转录、翻译、加工成所需产物的因素是多方面的，而选择一个合适的表达体系是获得目的产物高效表达的前提，常用的有原核表达体系中的大肠杆菌表达系统和真核表达体系中的酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统。
1、大肠杆菌表达系统
大肠杆菌（E.coli）是迄今为止研究得最为详尽的原核生物，作为一种成熟的基因表达系统得到了广泛的应用。由于其本身的一些特性，在大肠杆菌中表达目的基因必须满足如下条件。①目的基因编码区不能有插入序列，因为大肠杆菌表达载体不具备识别内含子、外显子的能力，因此真核基因在原核中表达时，应采用由mRNA逆转录的cDNA。②表达的目的基因要位于启动子的下游，且插入方向与启动子的方向一致。③转录出的mRNA必须有能与16S核糖体RNA 3'端相匹配的SD序列，才能有效地转译成蛋白质。④转译产物必须比较稳定，不易被细胞内的蛋白修饰酶快速降解。
大肠杆菌表达系统的显著优点是易于操作，成本低，产量高（表达量占细菌总蛋白量的10%-70%），但由于大肠杆菌不具备分泌系统，产物多以包涵体（inclusion body）形式存在于胞内，给分离纯化造成了一定的困难。此外还有一些原因也制约了真核基因在E.coli中的表达，如缺乏蛋白质加工系统，产物缺乏糖基化而易被降解；E.coli细胞间隙内含有大量内毒素，可导致热原反应。
2、酵母表达系统
酵母是一类单细胞生物，是生物学特性研究得比较清楚的真核模型之一，对酵母表达系统的研究较早、较快，已有一定数量的外源基因在酵母中获得了表达，如最早的基因工程乙肝疫苗的工程菌就是酵母。如果说E.coli是外源基因表达最成熟的原核系统，那么酵母则是外源基因表达最理想的真核表达系统，它具有很多优势：表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单；具有原核生物无法比拟的翻译后修饰加工系统；不含有特异性的病毒，不产毒素，属于安全性基因工程宿主系统；大规模发酵工艺简单，成本低廉；能将表达产物分泌至胞外，利于分离纯化，表达量约为菌体总蛋白量的10%-30%。
3、哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统因其具有准确的转录后修饰功能，表达的产物在抗原性、免疫原性和功能上最接近天然产物；具有产物胞外分泌功能，利于其后的分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力等优点而成为研究的一个热点，但也具有表达水平低（发酵液中目的产物的含量仅为0.2-200mg/L）、成本高、条件难掌握、易污染等缺点。目前最常用的哺乳动物细胞表达系统是CHO细胞。
采用哺乳动物细胞表达系统，其表达载体的选择取决于外源基因导入细胞的方式和mRNA的表达及蛋白合成的调控元件，常用的导入外源DNA的方法有理化方法直接转移（如脂质体、磷酸钙沉淀、显微注射、电穿孔法等）和病毒载体转染，常用的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒等。
哺乳动物细胞表达外源基因必须满足以下一些条件：具备哺乳动物细胞表达的功能元件，包括启动子、增强子、poly（A）加尾信号、终止子等元件；注意选择适当的选择性标记。此外，在选择稳定的表达细胞系之前，还可先进行瞬时表达研究，以鉴定整个表达系统是否适合这一外源基因的表达。
4、昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统是以昆虫细胞作为表达宿主细胞，常用来源于草地夜蛾的Sf9 细胞。其表达载体为杆状病毒，常用的有来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ACNPV）和家蚕核型多角体病毒（BMNPV），外源基因插入载体（来源于pUC系列）后，经与野生型杆状病毒基因组共转染昆虫细胞，通过同源重组整合入病毒基因中进行表达。
昆虫细胞表达系统具有高等真核细胞表达系统的优点，表达产物的抗原性、免疫原性和功能与天然产物较为接近，表达水平较高（发酵液中目的产物可达1-500mg/L），适合于高效表达外源基因，是一种很有发展前途的真核表达系统。
