从代谢机理的阐明．生产菌种的改良和发酵工艺的改进3个方面综述了丙酮丁醇发酵近年来的研究进展．针对丙酮丁醇发酵工艺中存在的问题，提出高丁醇耐受性菌种的选育，高丁醇比例菌种的选育、发酵细胞的高效利用．发酵与高效低能耗分离工艺的耦合等高产策略。一6613(20cr7)12—1727～06searchprogrsandhigheldstrategyofacetone-butanolfeentationinoqing，lan，g(couegeofifcsciencedtanlalngineeing，ajniofnology，j210009。igsu，llina)bstract：cer．butallofrementaononeoftllethrilngildusmfemlenprocesses．nsdeclilesince1950swcsedbyllleavajlabilit)rofmuchcheerdstocl(sfbrchenicalsolents)，ltllesisinⅡlepehemicalildusniltlleestionofpem)chemicalresos，acenebutallolfenondiplaysealeconbene6tsandtecsigcce．nⅡlispaper，lerecemresearchprogssinaclne—butalolfmnisevieildeil，ilcludilgⅡcalism，ilp0ntofpcilgs1sddevelopmentoffentadess．ighyiedsa；iesapntedtoolethee)isgpbllsinacetone-butalolfemlentanon，suchscreenillgllighbutal01lees，sc11ilgpucilgsnswitllllipr)portionofbutalol，1liiciencyuofent．producitcesaldcouplillgfemonwimkientsepprocesswilowenecolslon．eyworis：acetone-butanolfemlen叫on；如sf—讲肼；butalloltolerance；b1．eeding；f．enonprocesscoupedwitlls印aration丙酮丁醇是优良的有机溶剂和重要的化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业ll七。丁醇作为料，其热值和汽油相当，远高于乙醇，随着石油资源的匮乏，丁醇显示出在能源方面的实用价值3。丙酮丁醇发酵是一项传统的大宗发酵，曾是仅次于酒精发酵的世界第二大发酵过程4。我国从建国初期开始利用玉米粉进行丙酮丁醇发酵的工业化生产，同时也形成了稳定的发酵工艺11。由于石化工业的发展，丙酮丁醇发酵逐渐衰退5。但是随着石化资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出，利用可再生资源生产化工原料和能源物质受到高度重视同。丙酮丁醇发酵重新显示出竞争优势，菌种选育和发酵工艺的改进已经取得较大的进步阴。本文从代谢机理的阐明、生产菌种的改良和发酵工艺的改进综述了丙酮丁醇发酵近年来的研究进展，并针对丙酮丁醇发酵自身存在的问题，提出了丙酮丁醇发酵的高产策略。l代谢机理的阐明丙酮丁醇发酵己被阐明为产酸期和产溶剂期两个阶段，其代谢途径如图1所示。在发酵初期，产收稿日期2007一07一15；修改稿日期2007一0904·基金项目国家重大基础研究。9734项目(2003716004)及国家博士点专项基金项目(2004029l町)．第一作者简介靳孝庆(198l一)，男，硕士研究生。—m砌iaoqin95182001126．com．联系人何冰芳，教授，博士生导师。电话025—83587336；—mailbin醇ml她njut．edu．cn。·1728·化工进展2007年第26卷生大量的有机酸(乙酸、丁酸等)，p值迅速下降，此时有较多的c02和2产生。当酸度达到一定值后，进入产溶剂期，此时有机酸被还原，产生大量的溶剂(丙酮、丁醇、乙醇等)，也有部分02和2产生u。1．1产酸期葡萄糖是丙酮丁醇菌容易利用的糖类，经过糖戊糖戊．乳一一．烈．乙丙丁酵解途径产生丙酮酸。五碳糖也可以被丙酮丁醇菌利用，通过磷酸戊糖途径(删)，转化为6一磷酸果糖和3一磷酸甘油醛，进入伸途径。
丙酮酸和o在丙酮酸一铁氧还蛋白氧化还原酶的作用下生成乙酰一o，同时产生02。铁氧还蛋白通过铁氧还蛋白氧化还原酶及氢酶和此过程耦合，调节细胞内电子的分配和的果糖6．：习(2)甘油醛-3·-丽膏奠葡萄．氯化星缸素氯还蛋白2矿2r阴卜，+还原基红素氯还蛋白糟着图1丙酮丁醇发酵代谢途径弘1酶代号：a—3-磷酸甘油醛脱氧酶；b一丙酮酸．铁氧还蛋白氧化还原酶：c喇·铁氧还蛋白氧化还原酶；)．铁氧还蛋白氧化还原酶：c嘲．红素氧还蛋白氧化还原酶：f—氢酶：g—磷酸酰基转移酶；h一乙酸激酶；—硫激酶；卜3一羟基丁酰o脱氢酶；卜巴豆酸酶；卜一丁酰℃o脱氧酶；叶—磷酸丁酰转移酶；n一丁酸激酶；o一乙醛脱氧酶：p一乙醇脱氢酶；一醛脱氢酶；r—丁醇脱氢酶：一乙酰乙酰co：乙酸厂r酸：oa转移酶：卜-乙酰乙酸脱羧酶；lr—葡萄糖磷酸变位酶；v—-葡萄糖焦磷酸化酶；啊r一淀粉糖合成酶；r一淀粉糖磷酸化酶。
第12期靳孝庆等：丙酮丁醇发酵的研究进展及其高产策略·1729·氧化还原，同时产生2，。乙酸和丁酸都由乙酰一o转化而来。在乙酸的形成过程中，磷酸酰基转移酶(咒)催化乙酰一o生成酰基磷酸酯，接着在乙酸激酶的催化下生成乙酸。丁酸的形成较复杂，乙酰．o在硫激酶、3一羟基丁酰一o脱氢酶、巴豆酶和丁酰一o脱氢酶4种酶的催化下生成丁酰．o，然后经磷酸丁酰转移酶(m)催化生成丁酰磷酸盐，最后丁酰磷酸盐经丁酸激酶去磷酸化，生成丁酸8。1．2产溶剂期溶剂产生的开始涉及碳代谢由产酸途径向产溶剂途径的转变。这种转变机制目前尚未研究透彻。早期的研究认为，这种转变和p值的降低以及酸的积累是密不可分的。在产酸期产生大量的有机酸，不利于细胞生长，所以产溶剂期的酸利用被认为是一种减毒作用。但是p值的降低以及酸的积累并不是产酸期向产溶剂期转变的必要条件5。
乙酰乙酰一o：乙酸，丁酸：o转移酶是溶剂形成途径中的关键酶之一，有广泛的羧酸特异性，能催化乙酸或者丁酸的o转移反应。
乙酰乙酰一co转移酶在转化乙酰乙酰．o为乙酰乙酸的过程中可以利用乙酸或丁酸作为o接受体，而乙酰乙酸脱羧形成丙酮。乙酸和丁酸在乙酰乙酰一：乙酸丁酸：o转移酶的催化下重利用，分别生成乙酰一o和丁酰一o。丁酰-o经过两步还原生成丁醇。乙酸和丁酸的重利用通过乙酰乙酰一o：乙酸丁酸：o转移酶直接和丙酮的产生结合，因此在一般的间歇发酵中不可能只得到丁醇而不产生丙酮p。2生产菌种的改良丙酮丁醇发酵工业中的菌种主要是梭状芽孢杆菌属(c协川砒肌)，统称丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，简称丙丁菌。按照发酵底物的嗜好性不同可以分为两大类，一类是发酵淀粉的，如a傩，．淤趼l伽渤聊lr824和幻sf，．捌zlmcf6聪州fc姗l173l；另一类是发酵糖蜜的，如cfs川讲姗易f砌锄以ff、a吲蝴艘砌岣蜘咖8052和cf缸f砌堋阳c咖印而“钞zc配幻m1491。
丙酮丁醇发酵一度衰落，其原因除了石化工业的迅速发展外，还有该工艺自身的弱点。产物丁醇对细胞的毒性限制了总溶剂终浓度，导致后续成本较高，难以和化学合成法相竞争，所以菌种改良的目标就是选育高丁醇耐受性、高丁醇比例的高产菌种，以期大大降低生产成本。
诱变育种是目前丙酮丁醇发酵育种中广泛应用的菌种选育手段。
山西大学颜叙秀lo采用紫外线诱变处理，筛选到代谢产物提高、稳定性好的菌种，总溶剂比出发菌株提高约36％。上海植物生理研究所张益菜等1u用亚硝基胍和甲基磺酸乙酯先后处理，筛选到高丁醇比例的丙酮丁醇梭菌，百吨发酵罐试验中，丁醇比例达到71．9％，比原始菌株高10％左右。衄ous等用亚硝基胍做诱变剂，以葡萄糖的类似物2一脱氧葡萄糖作为抗代谢阻遏物筛选得到有很高淀粉酶活性的cfstrfdf“mf6l秒ffc“m101，其间歇发酵的丁醇含量可以达到19g，比出发菌株提高约100％。自20世纪80年代起，原生质体融合选育丙酮丁醇菌的相关研究开始兴起，eiuy等13研究了cf蒯f，，l卯f6比fy比“m的原生质体的制备和再生，在梭菌基本培养基(c)中添加0．4％甘氨酸有利于菌体原生质体的制备，添加ca2+、毋+可以提高原生质体的稳定性，在培养基中添加水解酪蛋白或者丙酮丁醇菌自溶物，可以提高再生率。
这为利用原生质体融合技术选育丙酮丁醇生产菌种奠定了一定的基础。
利用基因工程的手段进行菌种的改造，已成为当前的研究热点。eelstein等114构建了含有基因adc(乙酰乙酸脱羧酶)、ctf(o转移酶)、ctf(co转移酶)的质粒p6，转化closrimnceloblicc4，丙醌、丁醇和乙醇的产量分别提高了95％、37％和90％，而且转化菌株更加稳定。ourdcs等”1将cfsfrfdf啪钟勿如秽妇“m824中编码乙酰乙酸脱羧酶基因adc、o转移酶基因c以和硫激酶基因眦构建到载体p中，转化西砌成ll缸cff后，其丙酮产量和野生型协5驴豇阮删c幻妇秒触删相当，甚至超过野生型ff厂埘f“，，lc已幻6“钞fc“m。l(im等16将cz护汹“m钟盯“fm阼5的内切葡聚糖酶基因eng导入afr沥比m钯啦砌衣豇中，其内切葡聚糖酶活力比原始菌种提高了4倍，这对丙酮丁醇发酵中纤维素的利用具有很重要的意义。3发酵工艺的改进传统的丙酮丁醇发酵主要以间歇发酵和蒸馏提取的方式进行，目前产量一般只有15～18g。
以该生产方式，丙酮丁醇的产量只有达到22～28g，才能够有经济竞争力17。目前，较低的产物浓度导致后续分离提取占总成本的大部分，所以开发低能·1730·化工进展2007年第26卷耗的发酵与提取工艺对增强丙酮丁醇发酵的经济竞争力是至关重要的l71。丙酮丁醇发酵的生产工艺改进主要有4个方面：萃取发酵、气提发酵、渗透蒸发和廉价原料发酵。3．1萃取发酵萃取发酵是采用萃取和发酵相结合的方法，利用萃取剂将代谢产物从发酵液中分离出来，控制发酵液中丁醇的浓度小于其对微生物生长的抑制浓度，减轻或消除产物抑制l81。萃取发酵的关键是选择优良的萃取剂。浙江大学杨立荣等l8从13种有机物对肠j们胁“mcf6“印ffc“m的毒性以及它们的物理性质出发，选出了油醇和混合醇(油醇和硬脂醇的混合物)作为丙酮丁醇发酵的萃取剂，当初始葡萄糖浓度为1lg时，发酵后折合水相总溶剂浓度达到33．63g，，葡萄糖的利用率达到98．00％。江南大学胡翠英等1卅以4种生物柴油作为萃取剂，进行了丙酮丁醇萃取发酵研究，丁醇的生产强度最高可以达到0．213∥(．h)，比对照提高了10．9％。sl血aki等加以甲基化的天然棕榈油为萃取剂进行丙酮丁醇萃取发酵，结果47％左右的溶剂被萃取到棕榈油层中，葡萄糖的消耗率由62％提高到83％，丁醇产量由15．4g，提高到20．9g。3．2气提法气提法的原理是在一定温度的稀释液中，通入恒定流速的惰性气体时，溶液组分被气提到气相中，从而达到发酵产物的及时分离11。uresli等221报道在间歇发酵中，气提发酵可以利用199玑的葡萄糖，产生69．7g的总溶剂，远远高于非气提发酵。zeji等田1研究了气提分离工艺对丙酮丁醇发酵的影响，该工艺和间歇发酵相比，溶剂产率和产量分别提高200％和118％。以2和02为载气，采用半连续发酵和气提产物回收耦联的工艺，发酵201h，溶剂产率提高400％，总溶剂产量可以达到232．8g4。3．3渗透蒸发渗透蒸发是利用膜对液体混合物中组分的溶解与扩散性能不同，在膜两侧组分的蒸汽分压差作用下，对液体混合物进行部分蒸发，从而实现其分离的一种膜分离技术渊。由于渗透蒸发的高分离效率和低能耗的特点，使得它在丙酮丁醇发酵中有广阔的发展前景。渗透蒸发技术的关键是选择合适的膜，以期达到最佳的分离效果。ur；eshi掣冽合成了一种硅树脂一硅质岩膜，大大提高了对丁醇的流动性和选择性。iu掣驯使用聚合膜唧2533进行了渗透蒸发分离丙酮丁醇乙醇的研究，证明了该膜有很大的应用前景。3．4使用廉价原料廉价原料用于丙酮丁醇发酵可以大大降低生产成本。
丙丁菌可直接有效利用玉米等淀粉物质或糖蜜等原料，但这些原料的成本相对比较高。纤维素类、剩余农副产品、生活垃圾等原料已是丙酮丁醇发酵廉价原料开发的热点。esse等127以cfsfr泐m抛洳rf船兢lol为生产菌种，以压榨花生和农业废弃物为主要发酵底物进行丙酮丁醇发酵，总溶剂产量分别达到21．7g和14．8g，。荷兰学者以城市垃圾(w)作为底物进行丙酮丁醇发酵，在含10％而不添加任何其它营养物质的情况下每100g可以产生4g总溶剂，当添加一定廉价的纤维素和葡萄糖苷酶时，产量可以达到7．5g田。obay砸lli等刀在富含有机质的活性污泥中添加葡萄糖，以c2曲嘻也姗删c施印而“秒妇捌册lc删1—4为生产菌种进行丙酮丁醇发酵，丁醇终浓度可以达到9．3g。这些研究为丙丁菌的廉价底物发酵奠定了一定的基础，但其溶剂终浓度较低，尚缺乏实际产业化的意义。4影响丙酮丁醇发酵的因素丙酮丁醇发酵经历了由盛而衰的发展过程。影响丙酮丁醇发酵发展的因素主要有以下几个方面。
(1)溶剂的终浓度低。一般发酵后总溶剂的质量浓度在15～18g，因此产品分离的成本占总成本很大的比例11丌。(2)丁醇对菌种的毒性大。由于丁醇对细胞的毒性，当发酵液中丁醇的质量浓度达到11g时，50％左右的微生物因受丁醇的抑制而不能生长，从而影响了最终的溶剂浓度。(3)溶剂产率(单位质量的原料产生的总溶剂质量)低。以玉米原料为例，总溶剂产率一般只有30％左右l，这样低的溶剂产率使得发酵法在和化学法竞争时处于劣势。
(4)产物比例不符合需要。一般丙酮丁醇发酵中，产物丙酮、丁醇、乙醇的比例大概为3：6：151，而实际上需要更高比例的丁醇。(5)发酵原料价格较高。
目前丙酮丁醇发酵最常用的原料是玉米和糖蜜，而这些原料的价格相对较高，使得生产成本较高。
5丙酮丁醇发酵的高产策略以玉米或糖蜜为原料的间歇丙酮丁醇发酵工艺在我国以及许多其它国家已使用了几十年，和石油化工的合成工艺相比已缺乏竞争力。而石化资源的第12期靳孝庆等：丙酮丁醇发酵的研究进展及其高产策略·1731·匮乏推动了丙酮丁醇发酵的复兴。丙酮丁醇发酵复兴的决定性因素是溶剂产率、生产强度、生产成本特别是产物分离成本。围绕这3个决定性因素，提出丙酮丁醇发酵的高产策略。(1)高丁醇耐受性菌种的选育。
由于丁醇对细胞的毒性，发酵液中丁醇的含量难以达到较高的浓度，这大大影响了溶剂产率。提高菌种对丁醇的耐受性，是间歇发酵提高溶剂产率的先决条件。然而，由于丁醇对细胞毒性的复杂性，筛选耐丁醇的高产菌难度极高，目前几乎没有成功的例子。zllou等31报道，细胞自溶素活性的降低可以增加细胞对丁醇的耐受性。
他们用氯霉素处理菌种，使得自溶素的活性降低40％，丁醇的产量提高了30％。作者认为，原生质体融合是一种提高菌种对丁醇耐受性的好方法，将高耐受丁醇的菌和丙丁菌进行融合，理论上可能筛选到高丁醇耐受性的高产菌种。(2)高丁醇比例菌种的选育。一般丙酮丁醇发酵中，产物丙酮、丁醇、乙醇的比例大概为3：6：1，而实际上需要更高比例的有更广泛用途的丁醇。随着基因工程及代谢工程的发展，人们可以在现有研究的基础上进一步阐明代谢过程的限速酶，解除代谢过程中可能存在的产物或者中间产物的抑制，从而使得丙酮丁醇发酵快速高效的进行。
强化丁醇生产中的关键酶，如乙酰乙酰一o：乙酸，丁酸：co转移酶、丁醛脱氢酶等，加强丁醇的生成代谢，是提高丁醇比例的较好方法。另外，通过乙醛脱氢酶基因的敲出，切断乙醇生成代谢，减少乙酰．o的消耗，是提高丁醇比例的间接途径。(3)发酵细胞的高效利用。由于丁醇对细胞的毒性，现有的间歇发酵工艺中细胞的利用率较低。
可以通过开发连续发酵工艺，如多级连续发酵2、固定化发酵33一洲、细胞循环高密度发酵351，大大提高细胞的利用率。
(4)发酵与高效低能耗分离工艺的耦合。
传统的丙酮丁醇发酵生产中，产物的分离一般采用蒸馏，而这需要消耗大量的能量，生产成本较高。若能够开发新型节能的生产工艺，必将大大降低生产成本。原位萃取、气提和渗透蒸发等分离技术在丙酮丁醇发酵中的应用可以大大降低产物分离过程中的能耗，特别是膜分离工艺与发酵过程的耦合，必将极大的提高丙酮丁醇发酵的经济竞争力。
