随着基因重组技术的发展，选择表达系统对于目的产物制备是相当重要的，因为表达系统决定了
细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选
择合适的表达系统，对一种重组蛋白质的纯化通常采用多个系统.重组蛋白质在分离纯化的过程中，必
须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解.从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一直
是个难题.自20世纪70年代分子生物学技术诞生以来，促进生物技术公司加速了重组蛋白质纯化技术
的发展，在蛋白质纯化步骤、纯度以及节约成本等方面下大功夫，但纯化过程所需成本仍占总成本的
60 % ^- 70%，产物的溶解性、纯度、得率和纯化速率之间有牵制关系.蛋白质的分离纯化因其不同的性
状、片段大小、所带电荷和疏水性等因素采取相应的步骤，其中蛋白质的疏水性质使纯化过程变得更
加复杂.总的来说，纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，方法有浓缩沉淀、亲和层析、离子
交换、反相层析和膜过滤等.
1表达系统
1. 1表达系统的类型
重组蛋白质的表达系统主要有原核和真核表达系统，在真核系统中常用酵母和哺乳动物表达系统
等.对于单一结构和无修饰的蛋白质，原核系统稳定有效.Jo sh i等[‘〕报道重组人类白细胞素13 ( h um an
interleukin 13, IL 13)在IP T G诱导6h的蛋白质表达量最高.但若将宿主菌BL21 ( DE3)改变为BL21
(DE3) pLysS(带溶菌酶质粒)，纯化时不用外加溶菌酶.然而，许多真核蛋白的表达过程还需要有翻
译后修饰，如单链修剪、糖基化、磷酸化和酞基化等，表达初产物通过细胞基质时发生折叠、二硫键
形成以及翻译后转变.
大肠杆菌表达可溶性异种蛋白质时存在局限性，折叠时蛋白质有聚集的趋势以及容易被宿主的蛋
白质酶降解，聚集的趋势和机制取决于重组蛋白质本身.不同的重组蛋白质在大肠杆菌表达有的以可
溶性折叠物回收，有的以包涵体形式生成的蛋白质通过过表达的分子伴f吕变得可溶和有活性.已报道
过表达的分子伴f吕可增加重组激酶的溶解性，这为在大肠杆菌中大量生成和纯化可溶性的蛋白质提供
了基础.研究表明，此方法可适用于增强重组蛋白质的溶解性.
毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体.它具有表达率高、遗传稳定、产物可分
泌、发酵工艺成熟等优点E. cola表达重组体易于形成包涵体，限制了有活性产物的产量.毕赤酵母能
使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯[z}
哺乳动物细胞表达重组蛋白质的特点是表达产物不需要再折叠，合成是连续的，可完成翻译后修
饰.由CHO ( Chinese hamster ovary中国仓鼠卵巢细胞)分泌的蛋白质无需折叠，缺点是表达水平低
或产物不稳定.乳腺作为生物反应器之一，用于表达重组蛋白质的优点是产生高浓度的经过翻译后修
饰的可溶重组蛋白质.在转基因动物中表达重组蛋白质可解决再折叠问题和降低药品成本，并可保持
高浓度，但缺点是需要用数年时间使转基因动物成熟，在奶液中仍然有蛋白质酶可降解重组蛋白质.
近年来杆状病毒表达系统成为重要的表达蛋白质的方法.利用双链DNA病毒感染昆虫作为宿主，
因为缺少脂多糖(为毒性物质)，可分泌大量蛋白质到培养基中，使得后续的纯化更容易，可应用于抗
生素和胞外水解酶的生产.Pech an等[s〕用3种表达系统对于重组玉米半肤氨酸蛋白质酶进行比较，发
现杆状病毒表达系统产生正确加工和活性的蛋白质酶，E . cola表达系统产生有限的可溶和酶活的产
物，而毕赤酵母表达系统虽然生成大量产物，但多数是不溶和无活性的.此外，也可应用变形虫表达
在其他系统难以研究的异种蛋白质，特点是易于对蛋白质进行修饰.
1. 2包涵体的处理
大肠杆菌通常用于异种蛋白质的表达，然而过表达会产生不溶和无活性的多肤，不溶解的聚集物
通常成为包涵体，必须重新增溶、变性和复性以促进分子内正确二硫键和自然构象的形成.再折叠的
过程需要用改变物质化学本性的方法来增加蛋白质可溶性，如变性剂或强碱物质肌、氢氯化物、尿素
或碱的加入.以重组鱼生长激素变性和复性的优化条件为例，包涵体溶于6 mol/ L的盐酸肌，在pH 10
的缓冲液透析24 h，变性的重组鱼生长激素至少有20%复性.Pat r。等[a〕对比了重组人生长因子(recom-
binant human growth hormone, r}GH)在8 mo 1/ L尿素和6mo1/L盐酸肌中的溶解度，疏水作用和离
子交换作用是:-hGH包涵体形成的主要原因.r }G H包涵体完全溶解于100 mmol/LTris缓冲液
(pH12.5, 2mo1/L尿素).通过DEAF琼脂糖离子交换层析和排阻层析，r}GH纯化单体的产量占初
始包涵体蛋白质的50 %.重组人血红蛋白质以包涵体形式存在，8 mo 1/ L尿素溶解后，Q }epharose Fast
Flow阴离子交换纯化，经S ep h acry 1 100凝胶过滤纯化.结果两步纯化后重组人血红蛋白质的纯度达
90%左右，纯化产物复性后，具有与氧结合的能力[5]
控制包涵体的形成要认识折叠中间体的稳定性和与它们相互作用的因子.促进活性和稳定的蛋白
质构象状态形成的技术包括分子伴f吕帮助再折叠、氨基酸替代、去垢剂、聚乙烯乙二醇辅助折叠、颠
倒折叠胶粒以及抗体帮助折叠蛋白质，也可通过降低温度来增加产物的可溶性.Y an等[6〕报道了重组寡
肤酶B (oligopeptidase B, OpdB)的融合表达(在N端加组氨酸标记)，虽然大部分0 p<1B以包涵体形
式表达，但是当表达温度从370C变成300C时，0 p<1B的溶解性显著增加.这也说明合理参数的选择对于
蛋白质正确成熟是必要的(如温度、离子强度、辅因子等).一种条件就可能影响或控制折叠中间体的
聚集.也可通过改变氨基酸位置抑制聚集，对于低溶解度的蛋白质，有两种方法可考虑:(1)片层残
基的突变;( 2)可溶性基序的增加，在N端或C端增加3个赖氨酸基因.
2主要分离纯化方法
2. 1样品准备与预处理
样品了住备是最单调耗时的沙骤，其王要目标是在合适溶剂中析出物的浴解度，尽可能地从溶液中
移除杂质以及尽可能地进行病毒灭活.样品准备会由于重组蛋白质的可溶与否而截然不同.
从包涵体中回收蛋白质的第一步是细胞裂解.细胞裂解通常应用超声、高压匀浆或研磨，提高能
量、流量以及增加时间会促使细胞碎片的减少.为了减少细胞碎片的量，还要进行预处理.例如在高
压匀浆之前加热和酶的预处理可使杆菌释放热稳定酶.假丝酵母和酵母的酶预处理改良了细胞破碎效
果，低压匀浆减少了时间、能量消耗，减少了细胞碎片.包涵体洗涤和细胞破碎的整合也可减少下游
步骤.预处理后使得匀浆既在低压下进行又减少了在下游过程中包涵体洗涤的步骤，因为包涵体在破
碎过程中被释放和洗涤.对盐酸肌敏感的可溶的重组蛋白质在高压匀浆下可以从细胞中释放而不需要
预处理.
许多基因工程药物常受到毒性物质污染，有许多方法可以在不稳定产物中钝化病毒，但缺点是使
产物适用性受影响.例如过滤成本高且限制了产量;蒸汽加热耗时且会破坏蛋白质;辐射也会破坏蛋
白质;紫外照射对有些病毒是无效的，通常依赖于污染的感光性化学物质的激活，然而产物的光渗入
难以达到;洗涤剂对非油脂包被的病毒无效;臭氧系统难于控制，经常造成产物破坏以及化学污染.目
前发展的微波病毒灭活带来最小产物破坏，具有无污染、大规模、低成本以及宽光谱病毒灭活的优点.
2. 2层析技术
2. 2. 1层析方法的选择
大多数蛋白质纯化方案基于多步层析方法的次序排列.这些步骤有时是耗时低效的，因为合理纯
化方案的设计要求有完整的系统性.蛋白质和多肤是带有多功能和可变结构的分子，它们的层析行为
复杂.基质的选择十分重要，包被小的非孔粒子或极端大孔颗粒的柱子使得纯化效率提高.聚合树脂
粒子呈现不同基质的排列和功能性，比硅粒子持久耐用.在亲和层析中，聚合树脂比琼脂糖支持物持
久耐用.
对复杂蛋白质用单一的层析方法纯化是不够的，这里没有标准条件，只有不断选择试用.离子交
换层析(ID C)、反相层析(RPC)或亲和层析是两相分离的温和有效的主要方法.W。等[7〕报道了分泌
的重组内源血管发生抑制因子(endostatin, EDN)通过SP琼脂糖FF离子交换层析和琼脂糖拼素Hi-
T rap亲和层析纯化，纯度达到98% . W ang等[A〕使用CHOPS系统表达嵌合抗体以及发展了简单有效
的纯化方法，第一步用亲和层析，得率和纯度分别为60%和91%，第二步用反相高性能液体色谱法
(HPLC)纯化，纯度大于99%.液相层析技术中，目前主要在改进纯化操作系统的性能和提高载体介
质的性能上.此外，扩张柱床吸附、径向膜层析、灌柱层析、液液萃取、置换层析、金属鳌和亲和层
析等技术均在发展中.
对于下游纯化过程，还可用陶瓷轻磷灰石(CHT)，它是一种钙磷酸盐支持物，可替代离子交换
(IEX)和疏水相互作用(HIC).轻磷灰石是第一种用于蛋白质分离的材料之一，现在轻磷灰石变成机
械坚硬、化学稳定的陶瓷形式.Stole等[9〕在芽抱杆菌中表达Bi。工，纯化策略为离子交换、凝胶过滤、
轻磷灰石层析三步法获得Ba。工.W a<I。等[‘。〕利用杆状病毒表达系统表达重组环前列腺素合酶( prosta-
cyclin synthase, PGIS)，其以微粒体形式表达，通过磷酸钙凝胶吸收，再经过DEAF鲸脂糖和轻磷灰
石柱层析纯化获得PGIS.戴文氏杆菌致死因子(Bacillus anthracis lethal factor LF)融合蛋白质的纯
化通过3种层析步骤(苯基琼脂糖、Q鲸脂糖、轻磷灰石)，纯度达到95%以上[川.
2. 2. 2亲和层析
亲和层析技术对于重组蛋白质的分离纯化应该是最有效的方法.如果将一些亲和性标签构建到重
组融合蛋白中，能便于用亲和层析来纯化重组蛋白.
传统亲和层析过程用单克隆抗体(或多克隆抗体)作为亲和配基.但单克隆抗体通常由动物细胞
在复杂介质中生成或在噬菌体上表达，用于亲和配基前必须纯化.W agner等[}z〕使用哺乳动物表达系统
(CHO细胞)，用马的坛G1重链恒定区作为表达马的细胞因子(IFN}amma, IL 2, IL4, T GF-
betal)的检测和纯化的标签.
在亲和性标签中，金属和染料亲和配基相比于抗体配基有较低的特异性.金属离子如锌、铜在蛋
白质中与组氨酸残基结合.具有不同组氨酸残基数的蛋白质可被金属亲和过程分离.为了增加特异性，
可在蛋白质C端增加多争组氦酸.蛋白质纯化后，组W酸尾己可被切除.Fang等[‘J构建重组oxHis Vac
III基因于E . col a表达，表达的His融合蛋白质大多以包涵体形式存在.包涵体通过8 mol/ L尿素溶解，
Ni}VTA柱层析以及尿素梯度透析，得到高产的重组V acH I蛋白质.Chatter]，等[“〕报道了构建在N端
或C端结合六组氨酸或Streptag标记的表达载体表达L 2袋基酮脱氢酶，通过辅因子或重组烟草蚀刻
病毒蛋白质酶(rT EV)去除标记，纯化时用固定的金属亲和层析或st rcpt actin亲和层析一步即可.通
过rT EV去除组氨酸标记，L 2轻基酮脱氢酶获得完全活性.染色配基可与亲和基质通过共价键紧密结
合.它们或许是有毒性的，然而与蛋白质的相互作用是非特异的.很容易将一种染色配基结合到特定
目的蛋白质上，但是回收产物的纯度并不高.肤链是比抗体更稳定的配基，更具有特异性.相比于染
料，肤链是非毒性的.肤链和蛋白质相互作用是温和的，产生温和的洗脱分离条件.肤链数据库可由
噬菌体生成或化学合成.在噬菌体肤链数据库中，给定长度的任意基因片断被合成然后插入到噬菌体
基因中.一旦肤链顺序被确定，可化学合成并固定在支持物上.
融合蛋白质通常有容易纯化的特性.用于蛋白质纯化的标记有聚组氨酸(以镍离子作为配基)、
FLAG肤、抗生物素蛋白质链菌素、聚天冬氨酸(阴离子树脂)、聚精氨酸(阳离子树脂)以及聚苯丙
氨酸等.而参于亲和纯化的蛋白质融合伙伴有:蛋白质A、谷肤甘肤S摘专移酶、麦芽糖结合蛋白质、半
乳糖结合蛋白质、乃伴乳糖激酶、氯霉素乙酞转移酶、乳糖抑制物等.重组人胰高血糖素样}}C 1
(rhGLP一高密度发酵培养的菌体超声破碎后，裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到
G ST融合蛋白质，经CNBr裂解·QAE}epharos。柱层析和脱盐，得到纯度大于90%的rhGLP-1，质
谱测定相对分子质量结果与理论值一致.生物学活性分析表明，rhGLP一具有明显的降血糖活性[IS]. Lu
等[16〕用pGEX}p一载体在E. cola表达两种大米抗坏血酸过氧化酶APX基因(APX。和APXb), APX
以GST融合蛋白质表达，通过谷肤甘肤琼脂糖4B柱亲和层析，最终产量分别为40 , 73 m g.源于环状
芽胞杆菌W L -12的壳聚糖酶A1的壳聚糖结合区(Chitin-binding domain, ChBD)由45个氨基酸组成，
显示出显著的壳聚糖特异性，ChBD融合于乙内酞服酶基因编码区C端，在E. cola中表达，表达产物中
8%为可溶性蛋白质.融合ChBD的乙内酞服酶直接吸附在壳聚糖上，SDS}AGE分析显示，融合蛋白
质和亲和介质的联接有高度特异性、稳定性和可逆性[‘7〕.
2. 3其他方法
采用冻融循环可以从大肠杆菌胞质中有效分离重组蛋白质，沉淀方法可降低下游纯化成本.虽然
不是很有效，沉淀作为初始纯化步骤可减少后续步骤数.杂质通过沉淀去除，目的蛋白质留在上清液
中.蛋白质沉淀方法有改变pH,温度，使用卤化物、盐、有机溶剂(例如乙醇)、金属离子(例如铜)、
聚电解质(例如聚乙烯亚胺)、亲和配体以及染料、热敏可溶多聚物等.高盐沉淀是瞬间的、无定形的
沉淀，包含多种不同蛋白质，而结晶法可得到纯度高的结晶蛋白质.Hond。等[IA]纯化重组人生长分化
因子一(recombinant human growth differentiation factor 5, rhGDFS)(以包涵体形式表达)时，利用
值接再折叠”方法，通过过滤、等电沉淀、反相层析后，最终纯化产量为20%，纯度达到99%.与传
统3步层析法比较，纯度相同的情况下产量增加2倍.此外，膜蛋白质的纯化比可溶蛋白质困难的多，
可用连续洗脱电泳法获得更高的产量.
常规层析对于大规模蛋白质纯化是有局限性的，而膜吸附则具有快速、规模化的特点.Castilho
等[19〕利用CHO细胞系生产重组人类抗HIV免疫球蛋白质，用包含蛋白质A亲和配基的膜吸附器实现
细胞分离和产物纯化，免疫球蛋白质被吸附在亲和膜上，然后洗脱下来.I} n u<I sen等[ zoo尝试用阴离子
交换膜吸附替代传统的离子交换柱去除杂质如DNA、宿主细胞蛋白质和病毒实现重组单克隆抗体的纯
化，以求规模化生产.
3展望
基因技术的发展给人们更多关于控制蛋白质合成、折叠和分泌的信息，重组蛋白质分离纯化的发
展趋势之一是设计新的宿主细胞优化蛋白质生产和纯化.未来将设计整合生物过程以降低成本，这些
策略包括自动蛋白质表达系统、新的介质和柱技术、在线监测系统等.今后重组蛋白质的分离纯化的
技术发展将围绕着快速，高分辨率，易丁操作，低成不和屯脑控制的全自动化等技术而展开.
参考文献:
「1} Joshi B H, Puri R K.
that(onsist of hum
39(2):189- 198
欧阳立明，张惠展，
月n
Optimization of expression and purification of two biologically active chimericfusion proteins
int erleukin一3 and Pseudomonas exotoxin in Escherichia coli [J].Protein Expr Purif, 2005,
2000, 27(2):151-
Pechan T, Ma P W,
张嗣良，等.巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展【J].生物化学与生物物理学进展，
154
Luthe D S. Heterologous expression of maize (Zea mat's L.)Mirl cysteine proteinase in
el]一
门一一一一门一一一一
2，，
r..es F..es
karyotic and prokaryotic expression systems }J}·Protein Expr Purif} 2004, 34(1):134一141.
【4] Patra A K, Mukhopadhyay R, Mukhija R, et al. Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of
recombinant human growth hormone from Escherichir} coli [J].Protein Expr Purif, 2000, 18(2):182-
f51张浩，毛秉智，李晓霞，等.基因重组人血红蛋白质的纯化[f .11.中国生化药物杂质，2000, 21 (6): 274-
192.
277
【6] Ya n J B, W ang(;Q，Du P} et al. High-level expression and purification of Escherichir} coli oligopeptidase B [J}·
Protein Expr Purif, 2006, 47(2):645一65 0.
【7] Wu J, Fu W, Luo J, et al. Expression and purification of human endostatin from H a}ase}aula p olymorpha A 16 [J].
Protein Expr Purif} 2005, 42(1):12- 19.
【8]W ang J, Shi Y, Liu Y，et al. Purification and characterization of a single};hain chimeric anti-p185 antibody expressed
by CHOPS system【J].Protein Expr Purif, 2005, 41(1):68一76.
【9] Stok J E, De Voss J. Expression, purification, and c;harac;terization of Bio I: a c;arbon};arlmn bond c;leavin}。y_
2)
tochrome P4s0 involved in biotin biosynthesis in B ucillu.s .subtilis[Jl·Arch Bioc;hem Biophys, 2000, 384
一360
二3s 1
10]Wada M，Yokoyama C, Hatae T，et a 1.
synthase [J].J Biochem (T okyo)，2004,
Purification and characterization of recombinant human prostacyclin
13s(4):4ss- 463.
【11] park S} Leppla S H. Optimized production and purification of Bacillus uuthrucis lethal factor }J}·Protein Expr
Purif, 2000, 18(3):293一302.
【12]W agner B, Robeson J, McCracken M，et al. Horse cytokine/ IgG fusion proteins-mammalian expression of
biologically active c;ytokines and a system to verify antibody specificity to equine c;ytokines [J}·Vet Immunol Im-
munopathol, 200s, lOs(1/2):1- 14.
【13]FangCM，Zainuddin Z F, M usa M，et al. Cloning, expression, and purification of recombinant protein from a sin-
gle synthetic; multivalent cxmstruc;t of Mycobacterium tuberculosis [J].Protein Expr Purif, 2006, 47(2):341一3 47.
【14] Chatterjee S} Sc;hoepe J} Lohmer S} et al二High level expression and single}tep purification of hexahistidine-
tagged L 2-hydroxyisoc;aproate dehydrogenase making use of a versatile expression vector set[ J}·Protein Expr Pu-
rif, 200s, 39(2):137- 143.
[ is]张志珍，杨生生，毛积芳.重组人胰高血糖素样肤-1的表达、纯化及其生物学活性[J].中国生物化学与分子生
物学报，2002, 18 }1}: s- 8.
【16] Lu Z, Takano T，Liu S. Purification and characterization of two asc;orbate peroxidases of rice(Oryza sativ a L.)
expressed in Escherichia coli[刀.Biotechnol Lett，2005, 27(1):63- 67.
【17] Chern J T，Chao Y P. Chitin-binding domain based immobilization of D一ydantoinase [J].J Biotec;hnol, 2005,
117(3):267一275.
【18] Honda J, Andou H, Mannen T，et al. Direct refolding of recombinant human growth differentiation factor 5 for
large}cale production process [J].J Biosci Bioeng, 2000, 89(6):582- 589.
【19] Castilho L R, Anspach F B, Dec喻er W D. An integrated process for mammalian cell perfusion cultivation and
product purification using a dynamic filter }J}·Biotec;hnol Prog} 2002, 18(4):776- 781.
【20] Knudsen H L, Fahrner R L, Xu Y, et al. Membrane ion}xchange chromatography for process-scale antibody
purification [J] .J Chromatogr A, 2001，907(1/2):145- 154.
