上海师范大学食品添加剂和配料研究所 马正智 胡国华 方国生
溶菌酶(Lysozyme)，又称胞壁质酶、球蛋白G、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于Nicolle 1907年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子，1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。1965年英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究分析，第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。
溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织，且本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，将可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在我国，溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限，但可以预计溶菌酶将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。
1 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制
1.1 结构特点与复性
大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白，分子量在14000--18000左右。其等电点可达10.7，存在4个二硫键，正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存，其纯品为白色粉末状结晶，无臭、味甜，易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏，但在酸性溶液中其化学性质稳定，热稳定性很强，在pH 4～7时，100℃下处理1min酶仍保持良好的活性，在pH 3时，100℃ 加热处理45min 仍能保持活性[3]。溶菌酶在水溶液中62.5℃下，维持30min则完全失活，在20.5%的乙醇中，在62.5℃下维持20min而不失活[4]。王玮等[5]研究表明，在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。林翠花等[6]报道，人溶菌酶分子量为14600，由130 个氨基酸组成，也存在4个二硫键，其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2 倍左右。
在生产或应用溶菌酶时，由于工艺或环境的变化，极易造成酶的变性失活，因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现，当酶浓度较低时, 0.7mol/L的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外，溶菌酶和其它酶具有相似的性质，Karuppiah等[8]研究表明, 向复性溶液中加入适量的β- 环糊精, 可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80 %。董晓燕等[9]利用β- 环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用, 在适宜盐酸胍浓度下，溶菌酶可完全复性。王彦等[10]利用离子交换色谱法研究发现，当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为2.0mol/ L 时复性产率最高，当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。
1.2 溶菌酶的抗菌作用机制
目前已知的几种溶菌酶有：内-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β-1，3、β-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内-N-乙酰己糖胺酶、β-1，3、β-1，6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键，使糖苷键断裂，破坏细胞壁的分子结构，而酰胺酶等则主要作用于多肽，使多肽断裂。以内-N-乙酰己糖胺酶为例，内-N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β-1,4糖苷键，使肽聚糖分子发生断裂，使细胞壁内外两侧渗透压失衡，造成细胞破裂，导致微生物因细胞壁溶解而被杀死[12]。溶菌酶对革兰氏阳性菌（G+）细胞与革兰氏阴性菌（G-）的溶菌作用，由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差异，G+细胞壁含80%肽聚糖，而G-细胞壁只有在内壁层含有少量肽聚糖，因此，溶菌酶能有效杀死G+菌，而对G-细胞破坏很小。
2 溶菌酶的分离纯化方法
2.1 结晶法
结晶法是传统的提取溶菌酶的方法，此方法原料易得，制备过程不是很烦琐。起先Mayer Abraham等研究并利用此法，于1937年获得结晶状物质[13]，1945年Alderton等提出直接结晶法制备溶菌酶的方法[14]。杨景芝等[15]对传统结晶法做出了改进，通过调整透析液pH值，加入磷酸盐、再调整其pH值，然后离心去除杂质得到纯化液，使产率提高，活性增加。
2.2 离子交换层析法
离子交换层析法是根据各种蛋白质所带电荷数的不同而与离子交换剂之间结合力的差异，进而将不同蛋白质分离的技术。该法应用于溶菌酶分离始于80年代，由于其操作简便、高效、成本低、可自动化连续操作的优点,一直以来都是溶菌酶生产的常用方法[16]。目前国内外常用的离子交换剂有Duolite-464、724、732弱酸性阳离子交换树脂、D903、201大孔离子交换树脂、羧甲基纤维素(CMC) 和羧甲基琼脂糖等[17]。宋宏新等[18]采用724树脂,装柱后抽提液缓慢流入柱中，用缓冲液洗涤，再用硫酸铵洗脱，结果表明724树脂的吸附率达到83.5％。由于Duolite-464非常适合于连续自动化操作，因此利用它来分离纯化溶菌酶，可取得较高的产率。如Li Chan等[19]利用Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶,使溶菌酶的回收率达90%-95%。
2.3 亲和层析法
亲和层析法是根据酶与作用底物的特异性亲和能力，利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法[20]。它的应用始于上世纪70年代，由于底物可以专一性与溶菌酶结合，进而与其它蛋白分离，是一种高效的分离方法。目前，利用亲和层析法分离溶菌酶的报导很多，如He LZ等[21]采用多步亲和层析法分离纯化溶菌酶，结果表明利用三步亲和过滤系统从原料中纯化溶菌酶,与一步法相比产率从61%提高到了96%。
2.4 超滤
超滤是一种新兴分离纯化技术，利用控制超滤膜孔径大小来滤过杂质，水及小分子物质可以通过，从而获取产物。在反渗析及浓缩等工艺中广泛应用，同时在蛋白质分离中应用也开始兴起。与传统生化分离技术相比，它的优点是产品的产出量高、杂质少、纯度相对较高。在2000年，Ghosh R 等[22]采用小型的中空纤维超滤系统(30 kDa MWCO ,聚砜膜) 从蛋清干粉中分离溶菌酶，溶菌酶选择性透过膜,而其它大分子蛋白质被膜所截留。溶菌酶的粗提液经过超滤技术后，有时部分杂质如无机离子等未能全部除去，若将超滤与结晶法，或是与离子交换法等结合，将取得精制溶菌酶。邹艳丽等[23]报道，超滤浓缩溶菌酶经CM-Sepharose FF 阳离子交换柱后,纯度提高了21.9倍。张灏等[24]研究表明，将磷酸盐缓冲液稀释10倍,在24MPa下均质,利用截留相对分子质量为30000的聚醚砜(PES) 膜进行超滤，溶菌酶制品活力达到14610u/mg 。
3 溶菌酶活性的测定
目前国内外对溶菌酶活性的测定方法，主要有比浊法, 紫外分光光度法,比色测定法,琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等，但上述各种方法中均存在一定的缺点，如比浊法干扰因素多，重复性差，对单个样品测定速度快，比色法操作简单但误差较大[25]，因此各种方法都在不停改进中。传统方法测定溶菌酶活性时要将溶壁微球菌制成冻干粉，此过程不仅步骤烦琐而且易造成细菌大量死亡，影响结果。赵玉萍等[26]向溶壁微球菌直接加保护剂（20%的甘油）置于普通冰箱冷冻，使用时解冻，读第1min的吸光度值和第2min的吸光度值即可。使溶菌酶的测定方法更加节约高效，准确性又好。同样李德海等[27]也采取了类似的方法。而苍金荣等[28]采用聚苯乙烯微量反应板, 建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法,使标本用量减少, 反应时间缩短,灵敏度较好。近年来，许多报道采用标记乙二醇化几丁和0.1mol/L、pH值4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作底物，在600nm下来测定吸光度变化的简便方法，也取得了很好的效果。
4 溶菌酶在食品、生物医药等工业中的应用
溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内被消化和吸收，对人体无毒害作用，是一种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。由于溶菌酶具有良好的理化特性，具有一定的保健作用，如在化妆品中用可消除粉刺，使皮肤滑嫩，促进皮肤的新陈代谢；具有止血，促进组织再生的作用，如在牙膏中添加可防止牙龈出血、保护牙龈并具有杀菌作用。因此溶菌酶的应用领域非常广泛，在食品，医药，生物工程等方面都具有很大的应用前景。此外，溶菌酶除作为医药原材料外，仅在食品防腐、强化方面市场就比较可观，如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。随着对溶菌酶的研究的深入和应用产品的不断开发，溶菌酶一旦被人们认识接受，其对市场的占有率将大幅提高。
4.1 溶菌酶在食品中的应用
4.1.1 溶菌酶在乳制品中的应用
人乳与牛乳的最大差别之一在于溶菌酶的含量,在欧洲溶菌酶已经广泛用于婴儿食品添加剂，将一定量的溶菌酶添加到牛乳及其制品中，使牛乳人乳化[29]，能够强化血清灭菌蛋白，γ-球蛋白等防御因子，抑制肠道中腐败性细菌的增殖，增强婴儿对病菌的抵抗力。因此在牛乳或奶粉中添加一定量溶菌酶，不但防腐，而且强化营养，有利于婴儿健康成长[30]。此外，在奶酪产业溶菌酶也被广泛使用，如在干酪生产中替代硝酸盐，加入0.001%的溶菌酶，可防止干酪产气，保持香味物质丁酸[31]。德国于1995年11月22日发布了奶酪法规,批准使用溶菌酶来阻止在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所引起的胀气现象[32]。
4.1.2 溶菌酶在肉制品中的应用
低温肉制品由于口感鲜嫩，营养丰富，获得消费者的喜爱。但由于肉类冷藏的温度，并不能彻底杀死微生物或抑制其生长，因而保鲜期短，不能满足消费者需求。溶菌酶本身无毒、无害，可替代如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂添加到肉制品中，能有效延长食品保质期。如顾仁勇等[33]采用0.05％溶菌酶和0.05％Nisin混合液保鲜猪肉，4 ℃下可保鲜12d，真空包装保鲜期可达24d。而傅伟昌等[34]在此基础上添加了18％Nacl和4.5％葡萄糖组成复合保鲜剂，用于小包装分割冷却肉的保鲜，保质期明显提高。同样，曾友明等[35]将溶菌酶与Nisin、复合磷酸盐、茶多酚、酪朊酸钠组成复合保鲜剂与鲜肉混合，制成盐水火腿，其保质期可达3个月。同时，溶菌酶在红肠的加工，延长其货架期方面的报道也非常多。总体上溶菌酶在肉制品上的保鲜作用已经得到认可，并且取得了不少的进展，各种相关工作也在广泛展开。
4.1.3 溶菌酶在水果保鲜上的应用
经溶菌酶浸泡过的水果，其表面细菌被有效抑制，在防止烂果、延长水果保鲜期方面有重要意义。如章银良等[36] 研究指出，应用复合含溶菌酶0.07% , 氯化钙0.5% , 甘氨酸1.5%比例下的保鲜剂对草莓保鲜效果最好。又如吴晓英等[37]在溶菌酶涂膜保鲜杨梅中研究表明，加入溶菌酶的处理组，其烂果率、失重率，分别下降了60％、4.5％。
4.1.4 溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用
研究采用0.05％的溶菌酶、1.5%甘氨酸和3％的食盐溶液中将海产品或水产品浸渍5min，沥干水分，常温下保存9d后无异味、无色泽变化。溶菌酶的使用，极大提高了海产品或水产品的保鲜期，对其储存，运输等带来了很大的方便。
4.1.5 溶菌酶在低度酒及饮料中的应用
在低度酒中添加溶菌酶不仅对酒的风味无任何不良影响，还可防止产酸菌生长，是低度酒良好的防腐剂。在日本清酒中大部分微生物不能生存,但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长,并产酸使酒发臭，添加溶菌酶后火落菌被有效抑制，成功代替水杨酸作防腐剂用于清酒中[38]。倪瑛等[39]报道，向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶，可以大大减少SO2的使用量，减小了SO2使用过多可能对人体造成的毒害作用。此外溶菌酶还可以添加到果汁中作为防腐剂使用。
4.1.6 溶菌酶在降解壳聚糖上的应用
天然的壳聚糖广泛存在于虾壳、蟹壳及真菌中，在医学、食品等领域具有重要的应用价值，但由于壳聚糖分子量很大, 溶解性差使它的应用受到极大限制。研究表明,低分子量的壳聚糖不仅易吸收, 而且具有更强的生物活性[40]。目前发现溶菌酶在降解天然高分子壳聚糖有着得天独厚的优势。邓倩莹等[41]研究报道，溶菌酶可以大大提高壳聚糖的降解速率，无溶菌酶时,壳聚糖11天降解了19 %，而在溶菌酶的作用下,壳聚糖11天降解了44 %。
4.1.7 溶菌酶在其它食品中的应用
研究表明，用溶菌酶处理后的酵母，在培养过程中氮核蛋白质的释放量增加，提高了酵母蛋白利用率。面包、蛋糕、饼干等容易腐败变质的食品，在焙烤中添加一定量的溶菌酶，可起到良好的防腐效果。
4.2 溶菌酶在生物医药上的应用
4.2.1 溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用
随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶,用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等[42]利用其专一性水解细胞壁的特点，有助于人们对细胞壁细微结构的认识，为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础，同时作为是一种重要的破壁酶，在原生质体的制备方面提供了新的方法，因此溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。
4.2.2 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用
溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用，对大肠杆菌、普通变球菌等G-也具有一定程度溶解。此外，溶菌酶与抗菌素合用效果更佳，因而溶菌酶广泛应用于医药行业，如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症，尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显[43]。
4.2.3溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用
戴清源等[40]报道，正常情况下，人体尿液中一般只存在少量溶菌酶，因此测量尿中溶菌酶含量，有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时，烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍，也可在尿液中检出，有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外，血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。1996年Osserman 等[44]首先把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依据,提供了诊断急性白血病的新方法。
4.2.4 溶菌酶在牙膏、洗手液等产品中的应用
溶菌酶广泛应用于牙膏行业和漱口液的生产中，目前在日本已经生产出含有溶菌酶的漱口液和牙膏,研究表明这种产品可有效防治龋齿的发生。同时含有溶菌酶的洗手液也开始在国内生产，如国内某公司生产的洗手液，能有效防止手部细菌的增殖。
5 我国溶菌酶的生产应用现状和前景简述
随着环境的污染日益严重，科学技术的进步和人民生活水平的提高，人们对食品和医药的安全性要求越来越高,许多国家对某些化学防腐剂已限制使用，因此高效、安全、具有天然活性成分的溶菌酶势必倍受人们的关注。
目前国外对溶菌酶进行了较深入的研究，我国对溶菌酶的研究、应用起步较晚，虽然相继开展了一些有关溶菌酶提取和应用方面的研究工作，但与发达国家相比溶菌酶制造业规模小、设备和生产技术相对落后。当前国内外主要从蛋清中提取溶菌酶，因为从蛋清中提取溶菌酶,是一项生产相对简单、投资较少、见效快的工程,对于畜产品深加工、综合利用，均有巨大的经济价值。蛋清溶菌酶在国外已于20世纪80年代进入规模化生产，上世纪90年代末以来，已形成近千吨的市场规模，溶菌酶生产厂家主要分布在欧美亚等地。其中丹麦，加拿大，占世界市场的一半以上，由于我国生物酶工程研究起步比较晚，我国于上世纪80年代对蛋清溶菌酶技术开始研究，已多次列为国家“863”计划及“十五计划”等的重点科研攻关项目。目前国内已投产的蛋清溶菌酶企业有许多家，全国年产量不足50吨，溶菌酶的生产尤其是高活性的溶菌酶供应还不能满足我国日益增长的需求。
溶菌酶具有特异性，只能抑制某些细菌而不能降解真菌的细胞壁，若在今后食品应用溶菌酶时，还应注意几个事项：首先，要充分了解食品的营养成分、pH、食盐浓度等影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体，之前采取相应的预实验确定添加一定量的溶菌酶，才能达到有效的防腐效果。其次，为了更好的发挥溶菌酶防腐作用，可以与其它物质配比使用[46]。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可取得了很好的防腐效果。
近年来天然防腐剂越来越受到食品消费者的青睐，因此开发高效、安全、性能稳定和经济的天然防腐剂已成为国内外一个炙手可热的研究领域，而溶菌酶优良的理化性质恰好符合人们对食品安全性的要求，它将成为新型食品防腐剂中重要一员发挥愈来愈重要的作用。
全文转自《中国食品添加剂》期刊
