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雷帕霉素发酵生物活性的测定方法

   日期:2000-05-24     来源:医生在线    浏览:906    评论:0    
核心提示:中国抗生素杂志 2000年第2期第25卷 研究简报作者:白兰芳 武临专 徐小敏 王以光单位:中国医学科学院 中国协和医科大学 医药
  
 中国抗生素杂志 2000年第2期第25卷 研究简报
作者:白兰芳 武临专 徐小敏 王以光
单位:中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所,北京 100050
关键词:雷帕霉素;发酵;生物活性;直线相关
摘 要 由吸水链霉菌(Str.hygroscopicus)WY93-Z27中分离出具有抗真菌和免疫抑制活性的雷帕霉素,主要存在于菌丝内,少量分泌到细胞外。为适应大量菌种选育工作的需要,我们研究了:(1)几种处理菌丝的方法,结果以SDS裂解菌丝操作简便,省时,成本低;(2)固体发酵与液体发酵法生物活性结果没有正相关关系;(3)一定条件下,液体发酵上清液效价可替代菌体效价用于初筛工作。
Bioassay of rapamycin in fermentation
Bai Lanfang, Wu Linzhuan, Xu Xiaomin and Wang Yiguang
(Institute of Medicinal Biotechnology Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College, Beijing 100050)
雷帕霉素是从吸水链霉菌(Streptomyces hygros-copicus)中分离出来的三烯大环内酯类抗生素,它是一种有效的抗真菌剂[1],同时又是一种很好的免疫抑制剂并具有抗肿瘤作用[2~5]。由于雷帕霉素系胞内抗生素,其分泌到细胞外的量只占其细胞产生雷帕霉素总量的一小部分(有文献报道占其总量的15%左右,我们的实验也证实了这一点)。本文报道其发酵生物活性的测定方法。
1 菌株与培养基
雷帕霉素产生菌吸水链霉菌(Streptomyces hygro-scopicus)WY-93-Z27,本实验室来源。分离与固体发酵培养基(Bennett′s agar):酵母浸膏,牛肉膏,乳白蛋白水解物(lactalbumin hydrolysate),葡萄糖,琼脂。液体发酵培养基:葡萄糖,黄豆饼粉。
检定菌白色念珠菌(Candida albicans)10321,本实验室保存。培养基(%):葡萄糖4.0,酵母膏0.5,鱼胨0.5,琼脂1.2。pH8.0。
2 方法与结果
2.1 不同方法处理菌丝测定雷帕霉素发酵效价的比较
方法1 1% SDS(十二烷基硫酸钠)破细胞法
取2ml发酵液于小试管内,离心后于液面水平处作刻度,弃上清,加1% SDS至刻度处(即加至2ml),置60~65℃水浴保温20min,取出,加2ml N,N二甲基甲酰胺,混匀后离心,取上清液,再以pH6.0缓冲液稀释后测定生物活性(以效价mg/L表示,并以雷帕霉素HPLC 95%纯度样品作为标准品)。
方法2 超声波破碎
取发酵液5ml,冰浴超声波破碎,时间:8min(每次8",间歇2")取破碎后样品2ml于小试管内,加6ml二甲基甲酰胺,混匀,离心后取上清液用pH6.0磷酸缓冲液稀释后进行生物检定。
方法3 先超声破碎后SDS处理。
3种方法结果列于表1。
由表1看出, 1% SDS裂解菌丝细胞后所测效价作为100%。较其它两种方法高,说明SDS裂解细胞后抗生素释放比较完全。
表1 3种方法处理雷帕霉素生物效价的比较
菌株编号 超声波破碎
效价百分数
(%)*
1% SDS效价
百分数
(%)
超声波+1% SDS
效价百分数
(%)
 1 100  100   93.6
 2  85.0  85.0 100 
 3  70.0 100   80.0
 4  75.0 100   91.7
 5 100  100   96.9
 6 100   88.9  91.7
 7  77.4 100  100 
 8  88.9 100   88.9
 9  64.4 100   70.6
10  86.1 100   88.9
* 几种测定方法中同一菌株比较的相对效价,以效价最高的  已知甲醇浸泡菌丝释放雷帕霉素比较完全,又将SDS法与甲醇、95%乙醇、N,N二甲基甲酰胺浸泡法相比较。结果表明SDS裂解菌丝所得的雷帕霉素发酵效价与溶剂法接近。实际操作比较简单、省时,而且比溶剂法成本低,并可避免甲醇等溶剂的毒性,比较适于大量发酵样品的检测。
2.2 固体法测定雷帕霉素发酵生物活性
将Bennett′s agar培养基平板上长成的单菌落分别接种在注有同样培养基的牛津杯内,25℃培养10d后,将长有培养物的牛津杯直接置于白色念珠菌平板上测定其抑菌圈的大小。通过大量菌株两种方法(固体发酵与液体发酵)所得效价值进行直线相关分析[6],两者没有任何正相关关系,即固体发酵法中产生抑菌圈大的菌株,其产抗生素水平并不一定高。所以,即使是初筛,也不能采用固体发酵法。
2.3 液体发酵上清液效价与菌体效价的关系
由于雷帕霉素有少量是分泌于发酵液中,其分泌量的多少有可能与其菌体内的产量有正相关性。我们同样利用直线相关分析法对菌体效价与发酵上清液的效价进行线性分析,并对其相关系数r进行t检验以排除抽样误差因素,将用不同诱变条件处理后菌株进行发酵,测定其上清液及菌丝体中的生物活性所得4组数据,其相关系数r分别见表2。
表2  不同诱变条件处理菌种发酵上清液与菌丝效价
相关性分析
诱变条件     相关系数
1) UV+0.5% LiCl后处理 +0.253
2) UV单因子处理(光复活) +0.548
3) UV单因子处理(暗修复) +0.544
4) 甲基磺酸乙酯 +0.224
表2结果表明,上清液效价与菌体效价有不同程度的正相关关系。其中,UV单因子处理、光复活和UV单因子处理、暗修复两种方法中菌体效价与发酵上清液效价呈中等程度以上的正相关性。因此,在这种情况下可以用测定发酵上清液效价取代测定菌体效价进行初筛工作,以排除大量低产型菌落。但同时也发现,UV结合0.5% LiCl后处理与甲基磺酸乙酯处理后,菌体效价与发酵上清液效价的相关性较弱,推测可能是由于LiCl与EMS等一些化学物质对细胞有一定的损伤作用,影响到其细胞膜的通透性,使胞内外抗生素的含量的线性关系降低。因此,在对菌株进行化学诱变处理后,以上方法不一定再适用。
3 讨论
雷帕霉素为胞内产生的抗生素,只有少量分泌在胞外,为适应菌种选育中样品数量多工作量大的特点,需要建立简便易行能反映发酵液中雷帕霉素含量的方法,尤其是初筛时不大可能完全用HPLC方法进行检测。本研究在使雷帕霉素从胞内释放的方法学方面进行了比较,认为用SDS裂解细胞的方法比较省时,雷帕霉素的释放也比较完全。同时,发现测定发酵液上清抗白色念珠菌的活性与胞内雷帕霉素的含量有平行关系,用抗白色念珠菌活性检测胞内雷帕霉素的含量与HPLC检测的雷帕霉素组分也有一定的平行关系(数据略)。虽然,在S.hygroscopicus发酵液中也含有其他抗白色念珠菌的组分,但在我们以白色念珠菌作为检定菌,用雷帕霉素标准品制作生物检定标准曲线时所选用的条件是对雷帕霉素最敏感的(中心浓度为2mg/L)。在这样的条件下抗白色念珠菌的活性主要反映雷帕霉素的含量,即抗白色念珠菌的活性高,发酵液中雷帕霉素的含量亦高。因此本研究所建立的雷帕霉素生物活性检测方法有一定的实际意义。白兰芳,女,生于1972年,在读硕士生。
参考文献
1,Vezina C, Kudelski A, Sehgal S N. Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. Ⅰ. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. J Antibiot,1975;28(10):72
2,Tanaka H, Kuroda A, Marusawa H, et al. Structure of K506: a novel immunosupressant isolated from Streptomyces. J Am Chem Soc,1987;109:503
3,Calne R Y, Collier D S J, Lim S, et al. Rapamycin for immunosuppression in organ allografting. Lancet,1989:227
4,Douros J, Suffness M. New antitumor substances of natural origin. Cancer Treat. Rev,1981;8:63
5,Eng C P, Sehgal S N, Vézinac. Activity of rapamycin (AY-22989) against transplanted tumors. J Antibiot,1984;37:1231
6,倪宗瓒,余松林,杨珉,等. 医学统计学,1996:104
7,Cheng Y R, Hauck L, Demain A L. Phosphate, ammonium, magnetism and iron nutrition of Streptomyces hygroscopicus with respect to rapamycin biosynthesis. J Ind Microbiol,1995;14:425
1999年7月12日修回
 
     
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