1 试验部分
1.1 试验设备
5m3罐发酵装置及与之匹配的提取设备，各种检测仪器等。
1.2 菌种
由中科院微生物研究所提供。该菌种系由钝齿棒状杆菌(Coryneba Charm Crenate)AS1，542经亚硝基胍和快中子处理得到的L-421菌株。
1.3 发酵液
在搅拌下将葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、豆油等混匀即得。
1.4 试验方法与条件
1.4.1 发酵配方选择
实验确定采用的配方，见表1。
表1 发酵配方组成(%)
| 序号 | 原料名称 | 一级种子罐配比 | 二级种子罐配比 | 发酵配比 |
| 1 | 葡萄糖 | 3 | 3 | 15 |
| 2 | 硫酸铵 | 0.45 | 0.45 | 1.06 |
| 3 | 玉米浆 | 2 | 2 | 1.5 |
| 4 | 豆饼水解液 | 0.3 | 0.3 | 1 |
| 5 | 消沫剂 | — | 0.01 | 0.01 |
| 配料体积(L) | 30 | 300 | 2000 |
| 1.4.2 工艺条件选择 经试验选择工艺条件见表2。［3～5］ 表2 工艺条件选择 |
| 工艺条件 | 斜面 | 50L种子罐 | 500L二级种子罐 | 5m3发酵罐 |
| 消毒温度(℃) | 121 | 115 | 115 | 115 |
| 消毒时间(min) | 20 | 5 | 5 | 5 |
| 接种量(%) | 4支斜面 | 10 | 10 | |
| 培养温度(℃) | 30 | 27 | 27 | 27 |
| 培养时间(h) | 24 | 20～30 | 5～8 | 40± |
| 搅拌转速(r/min) | — | 180 | 185 | 185 |
| 罐压(mPa) | — | 0.1 | 0.1 | 0.09 |
| 通气量(m3/m3/min) | — | 1∶0.6 | 1∶0.6 | 1∶0.7 |
| 1.5 分析方法 1.5.1 还原糖测定：改良裴林氏法 1.5.2 pH测定：酸度计测定 1.5.3 菌体生长测定(OD)值 取发酵液1ml用蒸馏水稀释10倍或25倍，以蒸馏水作空白，以波长620nm，杯厚0.5cm测得的光密度值。 1.5.4 L-亮氨酸含量测定 取发酵离心液，在新华1号滤纸上点样2μl，置正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)系统层析剂中上行层析，晾干后，用0.05%茚三酮显色，用氰化钾-茚三酮-乙二醇-甲醚处理后，置721型分光光度计于570nm波长、5mm光程下进行测定。 L-亮氨酸%=样品光密度值/标准品光密度值×100% 2 结果与讨论 2.1 发酵条件试验 表3 通气量对L-亮氨酸产量的影响 |
| 通气量(V/V/min) | 1∶0.5 | 1∶0.6 | 1∶0.7 | 1∶1 |
| 产酸率(%) | 1.51 | 1.53 | 1.79 | 1.56 |
| 由表3可见，通气量增大到1∶0.7时，产酸率达到最大，这是因为增加通气量，一方面使KLa上升，改善溶氧传递；另一方面通气量适当增加，可将废气带走，改善了发酵环境。继续增大时，产酸率又下降，可见当通气量处于1∶0.7，发酵液中的溶氧浓度CL已略大于其临界溶氧浓度C临界［6］。这时则不能再增大通气量，如果再继续增大通气量，氧分压会随着上升，氧分压过大，会使菌种产生暂时的中毒现象而失活。因此，在实际生产中，务必控制其通气量为1∶0.7。尽可能有效地控制菌种对氧的呼吸。［7］ 2.1.2 发酵过程中pH对L-亮氨酸产量的影响 结果见表4。 表4 pH对L-亮氨酸产量的影响 |
| pH值 | 6.2～6.3 | 6.4～6.5 | 6.8～6.9 |
| 产酸率(%) | 1.74 | 1.75 | 1.35 |
| 从表4可知，pH对产酸量有很大的影响，当pH处于6.4～6.5时，产酸量最大，而继续增大pH，则反而使产酸量降低，其原因是该菌种在这个系统中同时进行着多条途径的代谢，因而产生不同的产物。其主要途径的选择受pH的影响很大。pH6.4～6.5最有利于菌种进行分泌L-亮氨酸的代谢，而当pH处于6.8～6.9或其它的值时，有利于选择其它的代谢途径，从而抑制了产L-亮氨酸的代谢［8，9］。因此，在实际生产中，一定要注意将系统的pH值控制在6.4～6.5范围内，使产酸量达到最大。 2.2 工业试验流程(略) 2.3 工业试验结果 测定了连续3批发酵液的产酸率，同时对980702批作了代谢图分析，结果见表5和图1。 表5 工业性试验抽查连续3批结果 |
| 罐批 | 周期(h) | 产酸率(%) | 转化率(%) | 放罐体积(m3) | 离交收率(%) | 总收率(%) |
| 980701 | 45 | 1.53 | 12.8 | 2.2 | 63.7 | 31.8 |
| 980702 | 43 | 1.81 | 13.8 | 2.2 | 90.7 | 32.3 |
| 980703 | 40 | 1.75 | 15.4 | 2.3 | 87.2 | 52.8 |
| 平均值 | 42.3 | 1.70 | 14.0 | 2.23 | 79.2 | 38.48 |
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图1 980702批代谢图 3 结论 3.1 通过工业性试验证实，中科院微生物研究所提供的L-421菌种产酸水平稳定。 陈辉芳(广东环球大冢制药有限公司 顺德 528303) 参考文献 1.国家药典委员会，北京快讯医药信息中心主编.医药快讯.1999，(116)：2～3 (收稿：1999-12-18；修回：2000-02-28) |
