本实验通过 L-谷氨酸的测定学习华勃氏呼吸仪的使用方法。
二、实验原理
大肠杆菌菌体内含有L－谷氨酸脱羧酶，能专一的催化L－谷氨酸脱羧，释放出二氧化碳。华勃氏呼吸计法是一种微量检压技术，可用于测定微生物和组织代谢时所发生的气体量的改变，如氧的吸收和CO2的产生。在恒温、恒容情况下，如果华勃氏呼吸计所带瓶内气体的量发生改变，则引起压力的改变(如放出CO2时瓶内压力增加)，由测压计上压力的改变就可计算放出CO2的量(每分子L-谷氨酸产生一分子CO2)，进一步求出L-谷氨酸的量。
三、仪器、原料与试剂
仪器
刻度吸管(2mL，0.5m，0.2m，0.1mL)、 注射器(2mL)、华勃氏呼吸仪1台(附测压管与反应瓶)。
原料
1.大肠杆菌丙酮粉的制备
将纯化的大肠杆菌由试管斜面培养接种到10支200mL茄形瓶培养基上，于37℃培养16~18小时。
2.培养基的配方如下：
蛋白：10g 牛肉膏浓缩液：5g
琼脂：20g 蒸馏水：1000mL
每一茄形瓶加入少量0.9％氯化钠溶液(生理盐水)，洗下菌体(可洗二次)，菌体悬液离心(2500rpm)弃去上清液，沉淀(菌体)悬浮于少量生理盐水中，置冰箱中冷却至20℃。
向己冷却的菌体悬液中加入10倍体积的冷丙酮(－10℃)边加边搅拌10分钟，静置，待菌体沉淀后，倾去上清液，菌体用布氏漏斗抽滤，并用冷丙酮洗菌体1~2次，滤液置真于干燥器内减压干燥，所得大肠杆菌丙酮粉装于密封瓶内，冰箱保存，数日内有效(现制备的要放入冰箱40小时后，取出研磨粉备用)。
试剂
1. 醋酸一醋酸钠缓冲液(pH5.0)：
A液：3M醋酸钠溶液：称取NaAC·3H2O(M＝136.09)40.8g溶于蒸馏水，然后定容至100mL。
B液：2M醋酸溶液：称取12g醋酸加蒸馏水定容至100mL。
将A、B两液按7：3(V/V)混合即得，使用时事先用pH计校正。
2. pH5.0 0.5M醋酸一醋酸钠缓冲液：称取30g冰醋酸加12g NaAC·3H2O产溶于100mL溶液瓶中，用蒸馏水稀至刻度。也可用3M醋酸缓冲液稀释制得。
3. 2％大肠杆菌脱羧酶液：称取2g大肠杆菌脱羧酶丙酮粉(制备方法附后)用pH5.00.5M的醋酸缓冲溶液定容至100mL。
4. 0.05mol/LL－谷氨酸溶液：准确称取L一谷氨酸0.7360g用蒸馏水定容至100mL。
5. 检压液(或称布洛的氏溶液)：
称取NaCl23g，牛胆酸钠5g，伊文氏兰0.lg(分子量960.83)，没有可以用0.lg甲基兰或酸性品红代替(呈色)。混合后再加麝香草酚兰酒精溶液数滴(防腐)(1g麝香草酚兰溶于100mL 40％酒精中)，用蒸馏水定容至500mL，比重为1.033，使用前需校正，若高于1.033时用蒸馏水调，低时用NaCL调。
四、操作步骤
l.将测压管与反应瓶洗净并在60℃下烘干，冷却后于各个磨口塞上涂上凡士林(最好用羊毛脂，真空油)。
2.将测压计固定在铁架上，放松螺旋压板，用注射器在橡皮管内加入检压液至刻度50mm处。
3.在反应瓶中加入各试剂
按上表装好试样后，与同一号码的测压管连接；用凡士林油封好磨口处，用皮筋系平；注意关闭侧室通风孔。
4.于水箱内加入温水至离水箱上部6cm处事先用温水调至37℃左右，杆上华勃氏呼吸计的电源杆头，打开电源总开关，调节水银触点温度计至37℃刻度处，打开加热开关，同时开动搅拌器，使水浴恒温在37℃。
5.将两幅(样品与对照)测压计，放在水槽侧内，固定在支架上，开动震荡器(120次/分左右)。
6.保温震荡10分钟，关闭三通活塞，调节螺旋夹，使左右两侧测压管中布洛的氏液面高度不同(左侧开口端液面约在230mm处)，记下液面高度，5～10分钟后；检查液面是否变化。如无变化，表示测压计不漏气，确认测压计不漏气后，转动三通活塞。使与大气相通。调节螺旋夹，使右侧(闭管，但此时与大气相通)管内液面在150mm处(参比点)，记下左侧(开口端)管内液面高度，此为反应前读数，关闭三通活塞。
7.用左手食指堵住测压管左侧口，取出测压装置，将小瓶侧室中的酶液倾入主室中，摇匀(注意勿使液体堵住气体出口)立即放回水槽中，并放开左手食指，将右侧液柱调节在150mm处。
8.振荡15分钟后，调正右侧液柱为150mm处，继续再振荡数分钟，调正右侧液柱至150mm处，读
取左侧液柱高度(终读数)(两付测压管同时做)。
9.打开两幅测压管的三通塞，使与大气相通，取出测压装置。关闭仪器的各个开关，用棉花擦去测压装置接口处凡士林，用水冲洗后浸泡在稀的洗液中，然后用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗干净，60℃下烘干。
五、计算
h1—样品瓶初读数mm液柱；
h2—样品瓶终读数mm液柱；
h1＇—对照瓶初读数mm液柱；
h2＇—对照瓶终读数mm液柱；
K1—对照反应瓶常数u／mm液柱；
K2—样品反应瓶常数u／mm液柱；
n—样品稀释倍数；
10—0.1mL样品换算成lmL；
147130—谷氨酸毫克分子量；
2240000—1克分子谷氨酸脱羧放出CO2的微升数(标准情况下)。
注意事项：
1.测定时水浴温度要恒定。
2.反应瓶与测压管是配套的，使用时勿搞错(对号)，附反应瓶常数K的测定。K的物理意义是：在标准状况下，测压管液柱增加1mm 时，反应放出CO2的微升数。
(1)计算公式：
上式中只有V需预先测定，其它都是常数。
(2)反应瓶体积V的测定(这里的V是指反应瓶容积与测压管的右侧管150mm处的体积之和)。
a、将测压管及反应瓶洗净，在60℃下烘干，备用。
b、汞的洗涤
将汞放入分液漏斗中，加3%硝酸，充分振荡，反复洗涤数次。再用蒸馏水洗至无酸性，然后，用锥形滤纸，在尖端用针刺一小孔。汞通过滤纸后，不洁物及水留在滤纸上，即得清洁的汞。
c、取干燥，清洁的贮汞瓶(或漏斗)下接橡皮管，管上夹紧螺旋尖子，将贮汞瓶夹在铁架上，于瓶中加入清洁的汞，将橡皮管下端与测压管的右侧相通，橡皮管连接处用铁丝扎紧，将测压管倒置，并倾斜一个角度，用自由夹固定的铁架上，先将储贮汞瓶放低，放松螺旋夹，转动三通塞子，使与测压管相通，使汞缓缓流入右管和支管内，再调节贮汞瓶高度和测压管的倾斜度，使右侧管内汞的液面恰好在150mm处，支管上汞的液而位置在离开塞子3－4cm处，用特种红色铅笔在液面处做一记号，然后，旋转三通塞子45℃，关闭测压管，放低贮汞瓶，再旋转三通塞子45℃。使塞子的侧孔与外界相通，放松螺旋夹，使汞回入贮汞瓶中，旋紧螺旋夹。然后，测压计右侧管三通塞子以上开口端的汞倾入储贮汞瓶内。最后将测压管内的汞全部倾入已知重量的清洁干燥的烧杯中，称重至小数两位(W1)。将汞注入反应瓶中，用尖的玻璃棒赶走瓶中的气泡，杆上侧室上的玻璃塞使汞充满主室与侧室(如侧室内有空气时，应把侧室上的玻璃塞旋通大气，以赶走空气。然后，关闭通气孔)使反应瓶测压管相连，用滴定管增减瓶内汞的量，使支管中汞的液面略高于记号处，然后，旋转侧室上玻塞，用手指按住通气孔，慢慢的放松手指，使支管内汞液面恰好在记号处，关闭通气孔，取下测压计，将反应瓶中的汞全部倾入已知重量的洁净小烧杯中，称重(W2)。
计算举例：
测压管内汞重W1＝4.32g
反应瓶内汞重W2＝205.42g
汞总重W＝W1＋W2＝209.74g
20℃时汞的密度φ＝l3.5462g/mL
所以，V＝W/φ＝209.74/13.5462＝15.48mL
以上操作应在通风柜内进行，因汞蒸汽有毒，在操作时应放一瓷盘，勿使汞滴流失；如有流失，应用滴管收集，如是小滴汞，可用湿毛笔蘸取，至于无法收集的汞滴，应撒上硫磺粉。
表3—10 计算反应常数时所要各种常数表
注：溶解数a是表示每毫升水在标准状况下所能溶解的气体毫升数
