发酵法生产谷胱甘肽的研究进展
The Progress of Glutathione Production by Microbial Fermentation
张冬冬（南通职业大学生物技术及应用064）
摘要 谷胱甘肽是一种重要的生理活性三肽,对维持生物体内合适的氧化还原环境起着关键作用,被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。微生物发酵法是目前谷胱甘肽生产的主要方法。综述了发酵法生产谷胱甘肽中优良菌株选育、发酵过程优化与控制等,并对发酵法合成谷胱甘肽需解决的问题进行了展望。
Abstract Glutathione(γ-glutamylcysteinylglycine,GSH is the reduced form),the most ubiquitous low molecular weight non-protein thiol compound,is widely dist ributed in almost all the aerobic organisms.Being one of the important physiological active peptides,GSH plays many physiological functions in the cells,for instance,maintenance of normal redox potential in the cells,radical scavenger,detoxification of various cytotoxic compounds,antioxidant,and so on.As glutathione has wide application potential in medicine,food...
关键词 谷胱甘肽;微生物发酵;菌种选育;工艺优化
Key words Glutathione; Microbial fermentation; Screening of high yield strains; Optimization of process
谷胱甘肽(Glutathione ,GSH) 是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的一种含γ2谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物,在蛋白质和DNA 的合成、氨基酸的转运、细胞的保护等重要的生物学现象中起着直接或间接作用。它主要分布于动物、植物、微生物细胞中,被广泛应用于临床医学、运动保健、食品加工等很多领域。因此,GSH 已成为各国科学家研究和探索的热点 。目前国内外生产谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法、酶法。由于发酵法生产GSH 具有菌种易于培养、原料来源方便廉价、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优点,已成为当前生产谷胱甘肽的主要方法。
1 生产菌株的选育
酵母是工业生产GSH 广泛采用的菌种,但普通的野生型酵母细胞中GSH 的含量并不高,为此人们采用物理或化学方法使出发菌株发生变异,然后在特定的培养基中进行筛选培养,使GSH 在这种变异菌株的细胞内大量积累,达到高产目的;或是通过遗传工程的办法对GSH合成代谢途径进行定向修饰,提高GSH 的产量。
1. 1 诱变育种 到目前为止,针对GSH 生产的酵母菌株而进行的物理或化学的处理方法大致有紫外线、X 射线、γ射线以及亚硝基胍等,而培养基中的特定筛选物质(筛子) 主要包括蛋氨酸、L2乙硫氨酸、DL2乙硫氨酸、1 ,2 ,42三氮唑、氰化钠、亚硫酸盐、酰胺和靛酚等。通过一系列对菌株的改良及选育工作,获得了很多GSH 高产菌株。其中,童群义等利用S . cerevisiae 2165 为出发菌株,采用紫外线诱导和亚硝基胍复合处理筛选出双抗变异菌株S . cerevisiae JN2528 ( Ethr Tri r ) 产量最高,比出发菌株提高了171. 3 %,GSH产量达到339. 1 mg/ L。
此外,刘娟等 通过挑选生物量较高的单倍体和谷胱甘肽含量高的单倍体作为融合亲株,构建了高产GSH的融合菌株ZJ F271 ,该菌株具有明显优于双亲的优良性状,GSH 产量可达185 mg/ L。
1. 2 基因工程育种 在GSH 的生物合成中,GSH 合成酶系的活性普遍较低,并且GSH Ⅰ是一个限速酶,其活性受到GSH的反馈抑制。因此,为了减轻GSH 对GSH Ⅰ的反馈抑制,需要提高酶系的活力或降低酶系对GSH 的敏感性。Murata等早期成功构建了具有较强GSH合成能力的重组E. col2i ,并从E. coli B 中筛选得到一株GSH Ⅰ脱敏突变株,克隆其gsh Ⅰ基因并在E. coli B RC912 中得以表达,获得的菌株合成GSH的能力大大提高。由于谷胱甘肽合成酶系是由GSH Ⅰ和GSH Ⅱ两个合成酶共同组成的,所以当GSH Ⅰ的活性提高以后,GSH Ⅱ就成了GSH 生物合成的限速酶。Gushima 等构建了含gsh Ⅰ或gsh Ⅱ的重组质粒并转化入E. coli 细胞,结果表明只有同时带有gshⅠ和gsh Ⅱ基因的重组细胞才表现出最高的GSH合成活性,其中提高GSH Ⅰ的活性比GSH Ⅱ更加重要。傅瑞燕等将从大肠杆菌获得的编码γ2谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的基因克隆到质粒pNZ8148 中,电转化乳酸乳球菌NZ9000 ,获得重组菌胞内谷胱甘肽含量达到358 nmol/ mg(蛋白) 。尧辉等将克隆gsh Ⅰ、gsh Ⅱ构建成双顺反子重组表达载体pT rc99A/ gsh Ⅰ2 gsh Ⅱ,建立GSH Ⅰ、GSH Ⅱ蛋白表达体系。以0. 08 mmol/ L IPTG于28 ℃诱导工程菌E. coli BL 21 ,谷胱甘肽合成能力达到湿菌体8. 5 mg/ g由于酵母菌中的糖降解酶活性较高,因此可以将gsh Ⅰ和(或) gsh Ⅱ基因转化进入酵母细胞内以获得高产GSH 的重组菌株。Ohtake 等尝试在酵母中表达E. coli B 的gsh Ⅰ基因,将gsh Ⅰ基因的全部编码片段与S . cerevisiae 98 的一个启
动子融合,结果转化体的GSH Ⅰ活性和GSH 的胞内含量分别提高了约100 和3 倍。Christine 等将含有E. coli 中gsh Ⅰ和gsh Ⅱ基因的质粒p INE Ⅲ转化到S . cerevisiae 中,明显提高了酵母合成GSH 的能力,GSH 在胞内的积累质量分数达到1. 8 %。在基因工程菌生产目的产物的过程中,必须考虑菌株所带质粒的稳定性问题,而质粒的稳定性受到宿主细胞遗传特性、质粒拷贝数以及质粒上基因的表达等多种因素的影响。为此李华钟等 针对质粒的不稳定性,将从重组大肠杆菌中提取能编码GSH Ⅰ和GSH Ⅱ的重组质粒转入新的宿主中,使重组转化子的遗传稳定性有了很大的提高,GSH 最终产量可高达7. 1 g/ L。即便如此,这些菌株还无法达到工业化生产的要求,目前仍停留在实验室研究阶段。
2 发酵工艺优化
生产GSH所用菌株通常能在很广的培养条件下生长并积累GSH,但产量很低。因此,要想进一步提高GSH 的合成能力,除选育优良菌株外还必须对培养基中的各种营养成分及培养条件进行优化,以实现目标产物的大幅度积累。
2. 1 培养基的优化 Liu 等 认为葡萄糖是啤酒酵母( S .cerevisiae AT CC7754) 生长的最佳碳源,蛋白胨是其最佳氮源。施碧红等则利用糖蜜作为啤酒酵母生产GSH 的碳源。卫功元等研究了不同碳氮源对C. utilis WSH 02208 发酵生产GSH的影响,结果表明蔗糖有利于促进细胞生长,葡萄糖对GSH 的合成有极大的促进作用;单一氮源对细胞生长和GSH产量明显优于有机氮源,混合无机氮源对GSH的产量有显著的促进作用。而刘娟等对融合菌株ZJF271 的发酵考察发现,培养基中蛋白胨浓度为1 %时,GSH 总量最高,无机氮源如硫酸铵、氯化铵等对细胞生长有一定的抑制作用,对GSH的产量影响不大。此外,一些无机离子(如Mg2 + ) 也是微生物发酵生产GSH必不可少的因子,微生物在缺乏Mg2 + 的情况下不能合成GSH,但若Mg2 + 过量,就抑制微生物合成GSH。李寅等研究发现,Mg2 + 浓度超过20 mmol/ L 后微生物生产GSH 的水平下降;陶锐等研究发现,Mg2 + 浓度在10 mmol/ L 时,微生物生产GSH的水平达到最高。Udeh 等[23]采用中心复合试验设计方法对发酵培养基中的主要成分进行优化,结果与优化前的情况相比提高近1倍。Liu 等[24]采用Box2Behnken 设计方案和响应面模型研究了葡萄糖、蛋白胨和MgSO4 质量浓度对S . cerevisiae 生产GSH的影响,也取得了令人满意的结果。卫功元等根据正交试验获得的数据,通过神经网络模型进行分析预测,对C. utilis发酵生产GSH 的培养基进行了优化,摇瓶条件下GSH 胞内质量分数达2. 35%,GSH产量和细胞干重也有较大幅度的提高。
2. 2 发酵条件优化 环境条件也是发酵法生产谷胱甘肽不容忽视的重要因素,其中影响细胞中GSH含量的环境参数主要包括温度、溶解氧、pH等。温度直接影响代谢过程中各种酶的活性,代谢反应速率,菌体生长量。卫功元等研究表明,较高温度可以降低底物对菌体生长的抑制,有利于细胞的生长,而低温更有利于谷胱甘肽的生物合成。童群义等在重组大肠杆菌E.coli2Ⅱ2 1 培养过程中提出了温度分阶段培养策略,即前期控制37 ℃培养菌体,后期降低温度增加酶的生物合成。氧气浓度对细胞生长和GSH 合成有显著影响,一方面影响着微生物的生长,另一方面对合成GSH的速率有促进作用。卫功元等研究了发酵罐中溶氧对产朊假丝酵母对分批发酵生产GSH的影响,当葡萄糖浓度为30 g/ L ,且通气量控制在5 L/ min 时,搅拌转速达到300 r/ min 即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。发酵液中的pH对营养物质的解离状态、酶活性、代谢速率有着重要的影响,因此pH也是制约GSH 生产的一个关键因素。卫功元等研究了pH对谷胱甘肽发酵的影响,结果表明,当pH值控制在5. 5 时谷胱甘肽总产量最高。
3 发酵过程调控
3. 1 葡萄糖的流加策略 GSH 的生成与发酵液中葡萄糖的消耗密切相关。研究发现,只有在葡萄糖几乎耗尽、生长停止时,细胞内才开始大量合成GSH;且由于GSH 是胞内产物,所以在提高生产菌株胞内合成GSH 能力的同时,还需要在发酵过程中设法提高细胞数,以提高GSH 的总产量。为实现这一目标,必须加大底物(如葡萄糖) 的质量浓度。但过高的葡萄糖浓度会产生Crabtree 效应,抑制细胞的生长并且目标产物得率会大大下降,因此一般采用后期限量流加葡萄糖的方法,以消除底物抑制,达到高密度细胞培养、延长GSH 的生产时间的目的。目前应用最多的葡萄糖流加策略有:恒速流加、指数流加、反馈控制流加。Shimizu 等 以葡萄糖作为发酵底物限制因子,考察了在S. cerevisiae 培养中比生长速率μ和GSH生产强度ρG 之间的关系,研究发现细胞在生长阶段时,通过指数流加控制葡萄糖使细胞在最大比生长速率μmax处;在GSH的合成阶段,通过反馈控制将葡萄糖的流加速率与乙醇浓度相偶联,控制细胞比生长速率μ在临界比生长速率μc处。Sakato 等通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的体积分数,运用前馈/ 反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率,使葡萄糖和乙醇同时被利用。发酵结束时GSH 产量为2 360mg/L ,比指数流加方式提高了40 %,胞内GSH 质量分数达到3.7 %。Alfafara 等 通过对发酵过程中乙醇产生的速度进行模糊逻辑控制,进而优化了S. cerevisiae 生产GSH 的流加发酵过程,GSH 的比生产速率达到6. 2[mg/ (g·h ] ,最终发酵水平提高了56. 0 %。李寅等比较了恒速流加、人工反馈控制流加和指数流加3 种补糖策略对重组大肠杆菌高密度培养合成GSH 的影响,发现指数流加方式最为理想。
3. 2 前体物质的添加 在前体氨基酸中,半胱氨酸为GSH合成的关键氨基酸,它的存在能明显提高细胞内GSH含量及GSH 的比生产速率,但阻碍细胞量的增加。在发酵过程中半胱氨酸的补加策略应以尽量减少对生长的抑制为原则。一
般有两种补加方式:
(1) 连续流加,保持发酵液中半胱氨酸的浓度恒定。数
学方程描述如下:
Cysteine 流加速度: Fc = ( C/ CF) [ kdV + F0exp (μ·t) ]
F0 =μ·V0 X0/ ( YX/ SSF)
式中, C 和CF 分别表示发酵液和补加液中半胱氨酸的浓度
(g/ L) ; SF 是流加葡萄糖浓度(g/ L) 。
(2) 定时补充。当发酵进行到比生长速率基本稳定时,加入少量高浓度的半胱氨酸溶液。加入时间选择在发酵的第2 阶段刚开始时。Alfafara 等考察了甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸3 种前体物质对酵母菌合成GSH 的影响,表明半胱氨酸是GSH 合成中的关键因子,同时还考察了半胱氨酸的补加策略,结果表明,连续流加半胱氨酸对整个发酵过程中胞内GSH含量没有显著提高,而一次性添加半胱氨酸可以大大提高GSH比生产速率。李寅等重点研究了流加前体氨基酸、ATP 、氨苄青
霉素对重组大肠杆菌生产GSH 的影响,结果发现,胞内GSH含量有所提高,但菌体生长受到抑制。
4 小结与展望
GSH是一种重要的调节生理功能的药物,在临床上的应用越来越广,已成为医学重要的具有调节人体免疫功能和辅助抗癌的药物之一。GSH 的抗氧化性又使它在食品工业中的应用备受人们关注,在食品贮藏保鲜和改善产品风味、提高产品营养价值方面的作用越来越被人们看好。虽然GSH的产品功效很大,但如何实现GSH 的工业化、产业化却是摆在人们面前的一个应对课题。在GSH 发酵生产已成为当前主要的生产方法时,还有很多理论和技术上有待攻克的课题。如:高产菌株的选育及培养条件的优化,发酵生产条件对GSH生产的影响及其发酵动力学数学模型的建立,GSH产物如何最大限度地从胞内提取出来和分离纯化技术的研究等。这些课题研究的深度和成熟度还远不能满足GSH 的工业化需要,这些理论和技术的难题随着相关学科的发展必定在不远的将来得以解决。
参考文献
[1 ] 胡学智. 日本的保健食品[J ]. 工业微生物,2000 ,30(3) :44 - 49.
[2] IKENO Y,TANNO K,OMORI I ,et al. Glutathione :日本,52087296. 1977.
[3] NOMURA K,SAKAGUCHI S ,HIRAKAWA K,et al. Glutathione by fermenta2
tion :日本,60244299. 1985.
[4] MAIKE J W,CHRISTEINE L H. High yield fermentative production of glu2
tathione2using Zinc resistant mutants of Saccharomyces , specifically the new
strain DSM7092 :德国,DE4219381. 1993.
[5] 施碧红,黄建忠,施巧琴,等. 啤酒酵母变株M205 合成谷胱甘肽的研
究:发酵条件研究[J ]. 福建师范大学学报,2000 ,16(4) :74 - 78.
[6] 童群义,陈坚,李华钟. 高产谷胱甘肽的酵母菌选育及培养条件研究
[J ]. 工业微生物,2002 ,32(2) :13 - 17.
[7] 贾建萍,裘娟萍. 谷胱甘肽高产菌株的选育[J ]. 微生物学通报,2003 ,30
(4) :24 - 29.
[8] 胡林华,谭天伟. 高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探
[J ]. 高校化学工程学报,2005 ,14(2) :273 - 276.
[9] KONO G,HARADA M,SUGISAKI K,et al. High glutathione2containing yeast :
日本,52125687. 1977.
[10] 詹谷宇,田萍,刘卫东,等. 酵母菌生物合成谷胱甘肽[J ]. 药学学报,
1990 ,25(7) :494 - 499.
[11] 刘娟,何秀萍,王雅琴,等. 高产谷胱甘肽的酵母融合菌株的选育及其
培养条件的研究[J ]. 微生物学报,2003 ,43(1) :99 - 103.
[12] MURATA K,KIMURA A. Some properties of glutathione biosynthesis deficient
mutants of Escherichia coli B[J ].J Gen Microbiol ,1982 ,128 :1047 - 1052.
[13] GUSHIMA H,MIYA T,MURATA K,et al. Construction of glutathione2produc2
ing strains of Escherichia coli B by recombinant DNA techniques[J ]. J Appl
Biochem,1983 ,5 :43 - 52.
[14] 傅瑞燕,陈坚,李寅. 构建重组乳酸乳球菌生产谷胱甘肽[J ]. 生物加工
过程,2004 ,2(2) :30 - 35.
[15] 尧辉,魏东芝,周宇荀,等. 谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构
建[J ]. 华东理工大学学报,2002 ,28(2) :144 - 148.
[16] OHTAKE Y,WATANABE K,TEZUKA H,et al. The expression of theγ2glu2
tamylcysteine synthetase gene of Escherichia coli B in Saccharomyces cerevisiae
[J ].Agric Biol Chem,1988 ,52(11) :2753 - 2762.
[17] CHRISTINEL H,ULF S. Recombinant yeast for manufacture of glutathione :欧
洲,300168. 1989.
[18] 李华钟,李寅,林金萍,等. 具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的
构建及合成反应过程[J ]. 微生物学报,2001 ,41(1) :16 - 24.
[19] LIU CHI2HSIEN,HWANG CHIN2FA,LIAO CHII2CHEMG.Medium optimiza2
tion for glutathione production by Saccharamyces cerevisiae [J ]. Process Bio2
chemistry ,1999 ,34 :17 - 23.
[20] 卫功元,李寅,堵国成,等. Candida utilis 生物合成谷胱甘肽的营养及
环境条件[J ]. 应用与环境生物学报,2003 ,9(6) :643 - 644.
[21] 李寅,陈坚,周楠迪. 环境条件及摇瓶补糖策略对谷胱甘肽发酵的影
响[J ]. 生物工程学报,1998 ,14(2) :147 - 152.
[22] 陶锐,吴梧桐,许激扬. 酶法制备谷胱甘肽工艺的研究[J ]. 药物生物技
术,1999 ,6(4) :203 - 207.
[23] UDEH KO,ACHREMOWICZ B. High2glutathione containing yeast :Optimiza2
tion of production[J ].Acta Microbiol Pol ,1997 ,46(1) :105 - 114.
[24] LIU C,HWANG C,LIAO C.Mediumoptimization for glutathione production by
Saccharomyces cerevisiae[J ]. Process Biochem,1999 ,34 :17 - 23.
[25] 童群义,陈坚. 重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件
[J ]. 无锡轻工大学学报,2001 ,20(3) :228 - 231.
[26] 卫功元,李寅,陈坚,等. 溶氧及pH对产朊假丝酵母分批发酵生产谷
胱甘肽的影响[J ]. 生物工程学报,2003 ,19(6) :734 - 739.
[27] SHIMIZU H,ARAKI K,SHIOYA S ,et al.Optimal production of glutathione by
controlling the specific growth rate of yeast in fed2batch culture[J ].Biotechnol
Bioeng ,1991 ,38(2) :196 - 205.
[28] SAKATO K,TANAKA H.Advanced control of glutathione fermentation process
[J ].Biotechnol Bioeng ,1992 ,40(8) :904 - 912.
[29] ALFAFARA C G,MIURA K,SHIMIZU H,et al. Fuzzy control of ethanol con2
centration and its application to maximum glutathione production in yeast fed
batch culture[J ].Biotechnol Bioeng ,1993 ,41(4) :493 - 501.
[30] 李寅,陈坚,伦世仪. 高密度培养工程菌生产谷胱甘肽[J ]. 中国医药工
业杂志,1999 ,30(1) :1 - 4.
[31] ALFAFARA C G,KANDA A,SHIOI T. Effect of amino acids on glutathione
production by Saccharomyces cerevisiae[J ].Appl Microbiol Biotechnol ,1992 ,36
(4) :538 - 540.
[32] 李寅,陈坚,毛英鹰,等. 前体氨基酸和三磷酸腺苷对重组大肠杆菌生
产谷胱甘肽的影响[J ]. 无锡轻工大学学报,1998 ,17(2) :11 - 15.
