微生态制剂已经广泛有应用于农业,养殖业和医疗卫生事业。其生产工艺主要有液体发酵、固体发酵和液固结合发酵等三大类。
一、液-固结合工艺的优点
1997年夏天,本所研究人员发现,一些益生细菌的培养必须经过液体阶段,才能达到理想结果。这些菌株以斜面-平皿-浅盘-大床或厚层通风工艺发酵所获得的产品与液-固结合发酵者相比,后者表现为:(1)细胞生活力强;(2)单位重要细胞数多;(3)培养体系抗杂菌能力强。
二、关于接种量
在细菌、酵母和丝状真菌的固体培养中,我们原来接种固体菌体的量一般为0.4-1%。1996-1997年发现,有些细菌接种量适当增加后,发酵物单位重量细胞数猛增。但有的细菌不适宜增大接种量,否则会引起细胞群体的快速老化。
三、好氧与厌氧发酵相结合
以固体发酵工艺生产厌氧或兼性厌氧微生物时,很难排除氧的干扰。我们先后用N2,CO2等工艺,但都不理想。1995-1998年间,采用好氧菌与厌氧菌等相结合的培养工艺,较成功得解决了O2的干扰。混合培养初期,好氧菌迅速繁殖,耗掉了基质中的大部分O2,兼性厌氧菌接着启动繁殖,最后是厌氧细菌的繁殖。只要三类菌接种比例适当,培养一般可获成功。
四、低水发酵
常规固体发酵培养基含水量一般在50-100%。1995年,本所联营单位开始研究低水发酵,已成功的有三个菌株,培养基含水只要达到28%即可获得理想的结果,只是发酵周期延长了。但延长发酵时候与干燥相比,在操作产量和经济效益等方面都是合算的,经过严密的动物实验,证实了低水发酵物的质量与常规发酵物一致。
五、培养基
固体发酵培养基的组成涉及成本和细胞量两大问题。既要细胞量大,又要成本低,这是发酵者的愿望。我们发现,在不易滋生微生物的培养基中加入一定的麸皮浸出汁、无机盐、糖浆等,能够刺激微生物早期繁殖。细胞量达到一定程度后,他们就在“难啃”的物料上繁殖。培养基的研究是无止境的。最近我们发现以豆类为主作培养基培养光合细菌,每吨成本仅10元,并且光合细菌繁殖快,单位体积细胞数量比传统培养基多2-3倍。
六、细胞与残余培养基的分离
很难将固体培养物中的细胞与残余培养基分离开来。但是液体培养物是可以的。例如光合细菌,残余培养基及光合细菌代谢产物对一些养殖动物的生产性能有负面影响,我们先是采用离心分离,但是代价高。后采用一种饮水沉淀剂,成功地解决了这一问题。只要在培养物中加入0.3%的沉淀剂,数分钟内细胞就会沉淀下来,细胞活力也不受影响。
七、双歧因子
一些小分子物质,例如寡糖,能够刺激双歧杆菌在动物或认得肠道中繁殖,因而称作双歧因子。动物食入双歧因子也有类似效果。双歧因子不是活菌,生产工艺较简单。将双歧因子与活菌制剂相结合,应用效果会更好。我们选用了一株能将固体培养物中的淀粉部分转化为双歧因子(低聚异麦芽糖等)的细菌,它本身就是益生菌。将它与别的益生菌混合培养,既获得了大量的益生菌,又制作出了双歧因子,这样的微生物制剂使用效果明显优于不含有双歧因子的发酵品。
八、包被(微囊)技术
以液-固结合工艺生产的微生态制剂,经瞬时高温挤压或添加微囊处理,可以获得微囊制品,这样的制品在耐高温、抗均、抗杂菌方面都具有优势,保存期一般延长36-120%。
九、正交实验
在多种微生物分别发酵然后按比例混合,或多种微生物接种于同一培养基中进行发酵时,各种微生物所占的比例的确定是很重要的问题。正交实验是解决这一问题的捷径。我们一般将一个菌株设三个比例:0,中等比例,高比例。然后按正交实验表进行组合。如何检验结果呢?一是用幼红鲫鱼、蛋鸡公雏作模型进行快速喂养实验,二是做猪或禽的中长期实验。作为消化道传染病的预防治疗剂,我们还做沙门氏菌对雏鸡的攻击实验以快速确定正交比例。近十年来,共进行了1626次这样的实验,与主观确定的配比相比较,其生物效价显著提高。
十、关于细胞检测
任何一个微生物制剂的质量都涉及到细胞生物量的问题。常用的检测方法是显微镜与活细胞培养。近十年来,我查访了数以百计的厂家或研究单位,他们使用的显微镜难以准确区分细胞和非细胞。建议有条件的单位购买Olympus显微镜。关于活细胞检测,同一样品,不同检测单位的检测结果相距很大。如何解决这一问题?第一,我们认为,微生物在多种可繁殖的培养基上培养时,以繁殖数量最多的培养基最好。我们基本根据文献或标准规定的培养基进行操作,但不妨在此基础上进行改进。例如1996年某微生态制剂在省级检测部门检测结果为0.12亿/g活菌,培养基稍作改进后,10次检测结果(平均值)变为47.8亿/g。第二,对于接种菌,尽量研究使用选择培养基。第三,注意稀释持续时间,室温下最好不要超过10分钟。否则,因操作时间过长,致使微生物在此期间内繁殖而得出假结果。第四,平皿培养基表面水份过多和培养局部环境空气湿度过大,都会因细胞随水迁移而造成检测数目偏高。
十一、关于微生态制剂的毒副作用
人们最关心的是所谓的“条件致病菌”。在长期的观察实验中,我们发现某些芽孢杆菌的确是条件致病菌。在某些条件下可诱发疾病。但并不是所有的芽孢杆菌都是这样。本所已应用的一株芽孢杆菌,在全国推广了整十年,生产出4.72万吨,用于畜、禽、鱼、虾饲养,从未发现它有致病作用。众多的自愿实验者每天服用50克,坚持60天,无一例外表现出无中毒症状,倒是治愈了多种肠道顽疾。我们对应用于生产的微生物一定要慎重,对于新种或首次应用菌种,先要进行系统的安全性毒理学实验,然后进行批量动物实验,确证无毒副作用后,方可正式推广。只要均种选择得当,微生物制品一般不会出现毒副作用。但要注意,一株现在无毒副作用的菌种,将来不一定无毒副作用。因为理化及微生物因素及菌种自身原因,有可能引起负性突变,因此定期对生产菌进行安全检测。
十二、微量饮水剂
近几年在全国推广应用的微量的微生态饮水剂,对于肉鸡饲养具有明显的经济效益。我们重复了EM技术引进者,中国农业大学李维炯教授介绍的方法和制剂,证实了EM的奇妙作用,获得了非常满意的效果。经常有人问,每只鸡每天喝0.1ml制剂,从细胞量或营养价值分析,不应该有太大的作用,为什么实际上作用如此之大呢?我们知道,微生物在适当条件下是要繁殖的,在饮水中,在消化道中都可以繁殖。由少变多,这可能是其中原因之一吧。近来,我们发现,在微量饮水剂中加入“功能性”物质,即不参与某些代谢的物质,可提高微量饮水剂的使用效果。尽管这类物质量极微,可以少到1-2个分子/升,但其作用是不可否定的。
十三、发酵剂
江苏沐阳县牧工商公司赵大中先生组织了50多家鸡粪发酵物养猪试验,取得了很好的效果。他们以50%的肉鸡粪(鲜),25%的秸杆粉,25%的玉米粉和麸皮,以本所的秸杆发酵厌氧菌厌氧发酵2-3天后,加入25%的类似于配合饲料的“精料”喂猪,全期料肉比为4:1,每公斤0.73元,每头猪多创收150-270元。中国人民武装警察部队医学院以2/3稻糠+1/3泔水(重量比)喂猪,经发酵的试验组增重比对照提高了35.62%。一是提高粗饲料的消化吸收率,二是微生物在动物消化道中起作用。
十四、高温制粒与细胞死亡
这是做作颗粒饲料时必须考虑的问题。一些芽孢杆菌具有抗高温作用,非芽孢杆菌抗高温能力差。我们曾对沈阳,连云港,黑龙江呵城等地的一些厂进行了8年的观察监测,发现一株蜡样芽孢杆菌在制料过程中几乎不死,其他菌死亡率为19-57%。看来,筛选耐高温的益生菌是重要的。微囊化后的制品,高温制粒死亡率较低。
十五、抗生素与微生态制剂
抗生素对微生物有拮抗作用。筛选具有一定抗性的维生素,就能使抗生素的拮抗作用减轻,我们以遗传工程筛选出一组具有抗多种抗生素能力的益生细菌,实践证明,这些菌在与抗生素合用时,效能发挥正常。但是要对这些菌定期进行抗性检测和遗传稳定性处理,不然就可能会失去其抗性功能。对于无抗性的菌株,应避免与抗生素合用。一般是采取交叉使用的方法。如果微生态制剂用量大,细胞量合格,饲料中的抗生素可部分或完全去掉。
十六、成功典范
1、辽河饲料:辽河集团应用本所微生态制剂的专利技术达19项之多。5年来饲料中未加抗生素。辽河饲料年产量达到数十万吨,深受用户欢迎。以它饲养所产的鸡蛋,胆固醇低,蛋白质高,不仅风味好,而且未检出有害物质和药残。以它喂养蛋鸡,产蛋高峰期延长20-30%。
2、生态宝:
采用液-固结合工艺生产,以正交实验法确定各组成菌最佳比例。细胞生物量大,是饲用产品中首家含有双歧因子者。由于采用了类似微囊技术,产品抗氧化,抗高温能力强,保存期也比普通产品长30%左右。筛选出具有一定抗抗生素的菌株,所以可在一定范围内与抗生素合用。它可替代抗生素,促进动物生长发育或产蛋,有明显预防和治疗消化道传染病功能,还可促进饲料转化,去除氨臭味,降低肉、蛋胆固醇,是目前国内外较理想的微生态制剂。生态宝由北京天地大科技有限责任公司独家生产。
3、EM原路:由江西省天意生物技术开发有限公司引进日本技术,开发生产了“EM原露”生物制品,其产品是散发刺梨酸的棕褐色半透明的液体。EM原露是由整个生态系统都存在的五大类微生物中的80多位“优秀分子”所组成,以适当的比例和独特的发酵工艺把经过筛选出来的有益微生物混合培养。形成多种多样的有益微生物群落。在全国已有数万农户、养殖户在使用,并取得了良好的效果。
4、华鲁饲料:济南浓缩饲料厂采用一种发酵物加鱼油替代鱼粉,低水发酵益生素酵母,以赖氨酸、蛋氨酸产生菌为主体的替代物替代50%的商品赖氨酸和蛋氨酸及光合细菌,益生素等技术,使饲料质量提高,特别是产蛋高峰期延长,料肉比、料蛋比低,深受用户欢迎。