谷祖敏，纪明山，魏松红，程根武，王英姿，祁之秋，张杨，李兴海
（辽宁上生物农药工程技术研究中心；沈阳农业大学植物保护学院， 沈阳 110161）摘要: 健根宝（Trichoderma viride + Bacillus subtilis）粉剂由绿色木霉TR-8和细菌BA-21复合发酵而成。研究结果表明TR-8菌株防治瓜类枯萎病的机制与TR-8菌株的竞争、重寄生有关，同时检测到TR-8具有分泌胞外葡聚糖酶的能力，对TR-8的抗生作用试验表明TR-8菌株的抗生作用不大，发酵原液对枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均无抑制作用。细菌BA-21菌株的作用机制主要是拮抗作用，产生抗菌蛋白，发酵培养48h几丁质酶活性达到高峰，培养24hβ-1,3-葡聚糖酶活性达到高峰。田间药效试验表明以1:50和1:60拌土穴施健根宝对西瓜枯萎病的相对防效比较理想，分别达84.20%和76.79% ，连续用健根宝粉剂400倍或500倍液灌根两次，对西瓜病枯萎病的相对防效可达78%以上。
关键词：健根宝；木霉；细菌；机制；田间应用
健根宝（Trichoderma viride + Bacillus subtilis）是一种新型高效的无公害生物农药，由绿色木霉TR-8（Trichoderma viride）和细菌BA-21（Bacillus subtilis）复合发酵后，经特殊剂型工艺加工而成，具有防菌谱广、药效持久、低毒无污染、对作物安全等特点，是防治土传、种传病害，解决重茬问题和生产绿色蔬菜、瓜果的必备生物农药。本文主要研究了该制剂中两种活体微生物的作用机制及其在田间的应用效果。
1 材料与方法
1．1供试菌株
拮抗菌：木霉菌TR-8菌株和细菌BA-21，分离自田间作物根际土壤。
病原菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）FO-G1，引起瓜类枯蒌病。
1．2 TR-8和FO-G1的平板对峙培养
在PDA平板上将培养3d的木霉菌TR-8和培养5d的尖孢镰刀菌FO-G1用直径0.9cm的打孔器打菌片，将TR-8菌片和FO-G1菌片同时接种到PDA平板上，两菌片间距离约4cm，定期观察。
1．3 TR-8对FO-G1重寄生现象的观察
将TR-8和FO-G1的孢子悬液混合后，取50μl滴在制水琼脂膜上，25℃下保湿培养，每12h观测一次。
1．4 TR-8菌株对FO-G1抗生作用的研究
1.4.1抑菌圈试验：将TR-8菌株接种在查彼培养基中发酵培养，25℃下培养5d，培养液于10000rpm离心20min，上清液即为发酵原液。将灭菌的牛津杯放置在PDA平板中央，向牛津杯中注入TR-8的发酵原液，周围涂抹高浓度的FO-G1孢子悬液，对照中注入无菌水。25℃下恒温培养，观测有无抑菌圈的产生
1.4.2孢子萌发试验：在PDA平板上加入1mLTR-8发酵原液，用玻璃棒将发酵液涂匀。以同样体积的无菌水作为对照。在超净工作台上放置1d，涂布FO-G1的孢子悬液。25℃下培养，12h后观察孢子萌发情况并计算孢子萌发率。
1.4.3菌丝生长试验：在PDA平板上涂抹TR-8发酵原液后，在平板中央接种FO-G1菌片，25℃培养，定期测量菌落直径。
1．5木霉菌TR-8发酵液中β-1,3-葡聚糖酶和胞外几丁质酶活性的检测
β-1,3-葡聚糖酶活性的测定参照汤章城（1999）方法，略有改动，几丁质酶活性的测定是以工业几丁质粉替换查彼培养基中的葡萄糖，配制以几丁质为唯一碳源的培养基，几丁质含量为10g/L。制成平板后接种TR-8菌片，25℃下培养，观测有无透明圈的产生。
1．6拮抗细菌BA-21菌株抑菌效价的测定
将BA-21菌株在NA培养基中培养48h后，培养液经细菌过滤器过滤，无菌滤液按一定的比例加入到冷却至45℃的PDA培养基中混匀，冷却后将直径为7mm的FO-G1菌片接于中央，置于26℃培养，以无菌水处理为对照，重复3次。待对照组菌落长至接近皿边缘时，用十字交叉法测菌落直径。
1．7 BA-21拮抗物的酶活测定
酶粗提液制备的方法参考陈崇顺（1999），几丁质酶活性测定方法参考阚国仕（2001）。β-1,3 葡聚糖酶活性测定方法如下：取定量的酶粗提液和含有海带多糖的0.2MpH5.0醋酸钠缓冲液混合，37℃水浴lhr，加1.5m 1蒸馏水和2mLSomogyi试剂，100℃沸水中水浴15min，立即冷却后加入2m1Nelson试剂和4m1蒸馏水，混合均匀后测520nm OD值。以每秒种产生的还原糖lnmol的酶量为一个酶活单位 (U)。
1．8根宝的田间药效试验
分别在沈阳市新城子区道义镇和新民市柳河沟镇进行。在道义镇选择连续三年种植西瓜的田块，设健根宝1:50、1:60和1:70拌过筛细土3个处理，以多菌灵1:50拌过筛细土作药剂对照，以不拌药过筛细土作空白对照。将药土均匀撒在播种穴内之后播种，每穴撒药土100g。每处理15m2，重复3次。播种55d后调查发病情况，计算相对防效。在柳河沟镇，选择连续两年种植西瓜的田块，设健根宝400倍、500倍和600倍液灌根3个处理，以施特灵500倍液灌根作药剂对照，以清水作空白对照。分别于5月20日和6月2日灌根，每株200ml。每处理20m2，重复3次。6月20日调查发病情况，计算相对防效。
2结果与分析
2．1 TR-8和FO-G1的平板对峙培养
木霉菌TR-8与镰刀菌FO-G1同时接种到PDA平板上后，木霉菌的生长速度快于镰刀菌，约2d后木霉菌与镰刀菌菌丝接触，在接触处菌丝产生褐变。随后镰刀菌停止生长，而TR-8继续向FO-G1方向生长，并可在镰刀菌菌落上生长，产孢，最后覆盖整个菌落。
2．2 TR-8对FO-G1的重寄生
木霉菌和镰刀菌孢子混合培养后在最初的24h中彼此独立生长，显微镜下观察不到相互作用。随后，TR-8菌丝开始向镰刀菌菌丝趋性生长，约36h光镜下可以看到木霉菌菌丝紧贴镰刀菌菌丝平行生长。在扫描电镜中可以看到多条木霉菌菌丝与镰刀菌菌丝平行和缠绕生长。有些地方出现菌丝瓦解现象。有的TR-8菌丝可以侵入或贯穿镰刀菌菌丝，侵染后在镰刀菌菌丝上产生小孔。
2．3 TR-8菌株对FO-G1的抗生作用
试验表明TR-8菌株发酵液处理和对照均未产生抑菌圈，镰刀菌菌落可绕牛津杯生长。TR-8发酵原液对FO-G1孢子萌发的影响见表1，在TR-8发酵液处理过的平板上FO-G1的孢子萌发率与对照相比没有显著差异；对FO-G1菌丝生长的影响见图1，从图中明显看出3d和7d的发酵液对FO-G1菌丝的生长没有抑制作用。
表1 TR-8发酵液对FO-G1孢子萌发的影响
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处理
|
平均萌发率
（％）
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t测验
两尾t值 t0.05
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发酵液处理
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94.77
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-0.456 2.306
|
|
对照
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95.11
|
2．4 TR-8发酵液中β-1,3-葡聚糖酶活性测定
木霉菌发酵液中检测到β-1,3-葡聚糖酶活性，5d发酵液的活性为4.52U/mL，7d发酵液的活性为20.15U/mL。随着发酵时间的增加，发酵液酶活性提高。
2．5 TR-8胞外几丁质酶活性的检测
TR-8在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长缓慢，菌丝稀疏，约1周后可产孢。但未观察到明显的透明圈，只是菌片基部稍有液化。
2．6拮抗细菌BA-21无菌液抑菌效价的测定
从表2可以看出，拮抗菌无菌液随着稀释倍数的增加，抑菌率逐渐降低。稀释5倍时，抑制率为80.7%，稀释1000倍时，抑制率为2.4%，基本可以确定无菌液的抑菌效价为1000倍。此外，当抑制率为50%时，无菌液的稀释倍数为50倍，因此也可初步断定其EC50为50倍。
表2 BA-21无菌液抑菌效价的测定结果
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稀释倍数
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抑菌圈直径（mm）
|
抑制率（%）
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对照直径（mm）
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5
|
23
|
80.7%
|
90
|
|
10
|
28
|
74.7%
|
90
|
|
20
|
34
|
67.5%
|
90
|
|
30
|
39
|
61.5%
|
90
|
|
40
|
42
|
57.8%
|
90
|
|
50
|
46
|
53.1%
|
90
|
|
100
|
54
|
43.4%
|
90
|
|
200
|
59
|
37.3%
|
90
|
|
400
|
65
|
30.1%
|
90
|
|
600
|
72
|
21.7%
|
90
|
|
800
|
78
|
14.5%
|
90
|
|
1000
|
81
|
2.4%
|
90
|
2．7拮抗细菌BA-21 几丁质酶活性测定
BA-21发酵液不同时间取样处理均测出了几丁质酶活性，12 h即可测到几丁质酶活性，但活性很低，在24h后活性迅速增高，第48h出现高峰，在第60h、72h、84h至96h基本处于稳定水平，第96h以后活性呈下降趋势，至132h活性降到较低水平。
由图3可见该菌株在液体培养条件下，可以代谢产生β-1,3 葡聚糖酶。此酶达到高峰时间比几丁质酶短，在培养后第24h即达到高峰状态，此后在第36h至第60h均保持较强活性，到第96h活性开始转弱。而其活性曲线与细菌生长速度不完全同步，酶活性高峰早于生长量高峰。这与几丁质酶活性相比基本相似，但也略有差异。
2.8 拮抗菌对西瓜枯萎病的田间防治试验结果
表3健根宝对西瓜枯萎病的田间防治结果（道义镇） 表4健根宝对西瓜枯萎病的田间防治效果（柳河沟镇）
在新城子区道义镇进行的健根宝粉剂拌土于西瓜播种时穴施，防治枯萎病田间试验结果见表3。健根宝粉剂1:50和1:60拌土穴施对西瓜枯萎病的相对防效比较理想，分别达84.20%和76.79%，显著高于多菌灵的相对防效。拌土穴施健根宝粉剂处理的西瓜植株生长旺盛、健壮，叶片呈深绿色，这与室内防治试验结果相似，进一步证明健根宝有促进植株生长的作用。
在新民市柳河沟镇进行的健根宝粉剂灌根防治西瓜枯萎病试验结果，见表4。在发病前和发病初期，连续用健根宝粉剂400倍或500倍液灌根两次，对西瓜病枯萎病的相对防效可达78%以上，显著高于对照药剂施特灵。
3讨论
木霉菌对病原菌的拮抗机制在国内外已经得到广泛的研究，人们普遍认同的三个重要机制是重寄生、抗生作用和竞争作用。本文对木霉菌TR-8菌株对瓜类枯萎病菌FO-G1的多种拮抗机制进行了研究，可得出如下结论：（1）对峙培养中TR-8快速生长并覆盖FO-G1的菌落，表明了TR-8在空间和营养竞争中的优势；（2）孢子混合培养中观察到TR-8菌丝平行或缠绕镰刀菌丝生长，甚至可以侵入或贯穿镰刀菌菌丝，侵染后在镰刀菌菌丝上产生小孔，证明了重寄生作用的存在，并同时检测到了胞外β-1,3-葡聚糖酶活性；（3）发酵原液中没有抑制菌丝生长期和孢子萌发的拮抗物质，可见抗生作用不是TR-8的主要拮抗机制，至少在离体条件下是这样。
许多研究证明：由拮抗细菌产生的抗生素、酶和挥发物等代谢物在控制多种植物病原菌中起关键作用，拮抗作用是生防细菌参与的重要机制之一。几丁质与β-1,3葡聚糖是构成真菌细胞壁的重要组成成分，本文通过研究证实了BA-21菌株在其生长代谢过程中可产生几丁质酶及β-1,3葡聚糖酶，这为其抑菌机理提供了可靠的依据。
西瓜枯萎病是一种典型系统性侵染的土传病害，病菌从根部以及根毛顶端细胞侵入维管束，在导管内发育堵塞导管或引起植株中毒而萎蔫死亡，特别是重茬栽培，发病更为严重。国内外虽已进行了大量的综合防治技术研究，但直到目前为止，仍无根治良方。健根宝粉剂以1:50拌土在播种时穴施，对西瓜枯萎病的防效最佳，高达80％以上，且省工、省药，为防治西瓜枯萎病提供了一条新途径，是发展绿色农业较为理想的生物农药。。
参考文献
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