微生物法降解植物甾醇侧链生产17-酮甾体研究进展

摘要：微生物法降解植物甾醇侧链，生产雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD），雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD），和9a-羟基-AD甾体药物中间体的工业生物技术对解决甾体激素药物半合成原料薯蓣皂素短缺的现状，实现甾体激素药物半合成原料多元化，合理利用我国甾体植物资源具有重要意义。本文重点评述微生物法降解植物甾醇侧链制AD, ADD和9a-羟基-AD的研究现状，内容包括：1）微生物菌种选育；2）菌种相关的细胞生理，酶学性质和生物催化过程；3）相关酶的细胞定位及生物反应器；4）发酵工艺选择和甾醇原料合理利用。

关键词：植物甾醇；微生物发酵；降解侧链；生物制造AD，ADD和9a-羟基-AD

建立微生物发酵降解植源性天然产物混合物中谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇等甾醇侧链，生产雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD），雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD），和开发9a-羟基-AD甾体药物中间体产品的生物制造技术，对改变我国甾体激素药物半合成原料薯蓣皂素短缺的局面，实现甾体激素药物半合成原料多元化，科学合理利用我国甾体植物资源具有重要意义（图1）。

图1 微生物转化植物甾醇生产3种有用甾体

Fig.1 The process of steroid production from raw material phytosterol to final? products by microorganisms

国外甾体激素药物，特别是性激素避孕药的生产过程，由于可使用甾醇发酵降解产物AD（D）作为半合成中间体，但该类甾体激素药物的生产工艺已发生很大的变化，使得传统上由薯蓣皂素制造性激素避孕药物工艺已柀工业化规模生产的AD（D）流程所取代。同时，9a-羟基-AD在化学结构上9α-羟基的存在，可借助常规的化学合成手段形成C_9，11-双键体系，从而顺利地在C₉-位引入一个卤原子，C₁₁β-位形成必不可少的功能羟基，该中间体可用于合成糖皮质激素抗炎药和高效含卤（氟，氯）皮质激素。这就可解决国内现有薯蓣皂素工艺路线的瓶颈——环氧黄体酮低效的C11α-羟基化霉菌发酵步骤，可对国内已有的地塞米松，倍他米松等9a-卤（氟，氯）皮质激素以及C₁₁-酮结构的可的松/强的松合成工艺整合进行皮质激素生产产生巨大的影响。早在1979年美国暜强制药公司报道利用偶发分枝杆菌突变株发酵谷甾醇断侧链，有效积累中间体9α-OH-AD，以此中间体经7步化学合成，制得乙酸氢化可的松，总收得率36.7%

表1. 17-酮甾体的发酵生产

Table 1 Fermentation production of 17-ketosteroids

开发利用植物甾醇，必不可少的前期工作就是分离可供微生物降解的植物甾醇底物，发酵工艺的选择又依赖于选育菌种的性能，如通常的分枝杆菌可因为豆甾醇组份的存在而抑制发酵降解活性，导致积累目标产物浓度降低。已经报道选育分枝杆菌突变株，可生物转化蔗糖工业废物中富含β-谷甾醇和豆甾醇原料，且该突变株可解除因豆甾醇导致的产物抑制活性问题。由于植物甾醇来源不同，具有不同的化学组成，微生物对甾醇底物具有不同的亲和力，这将对发酵降解作用产生影响。

甾醇的发酵降解断侧链，产生C-17酮甾体AD（D），9α-OH-AD）是一个复杂的微生物多酶体系分解代谢过程。因此，分离筛选合适的工业微生物菌种，对菌种在遗传学和生理生化，分子细胞水平复杂性问题的研究以及经由逐级放大考察生物催化及其生物加工过程，相关参数优化等的实验研究工作都属于工业微生物及其生物制造技术基础研究内容。早在20世纪80年代国外就已经达到1 000 t/a级的工业化水平。进入21世纪以来，德国先令公司（柏林），借助选育的分枝杆菌突变株工业发酵植物甾醇生产AD和ADD，发酵罐生产规模已达200 m³。我国已有利用50 m³发酵罐发酵进口植物甾醇生产AD，再经霉菌氧化得到11a-OH-AD，结合化学法在C-17酮基接上双羟丙酮侧链，产出乙酸可的松的研制工作。结合笔者所在实验室近年已开展的分枝杆菌发酵植物甾醇断侧链，形成9α-OH-AD的初步研究结果以及相关文献报道予以综述分析。

1.      微生物菌种选育和选择

菌种选育的所谓“逆向选择法”，即利用分枝杆菌NRRL-3805亲株作为出发菌株，对总甾醇降解菌株经UV诱变后，选择出具有对甾体1(2)-脱氢酶和9a-羟化酶活性双重阻断的目标菌种。已经选育出的M. vaccae ZIMET 11052，11053就是这种能由谷甾醇转化生成9a-OH-AD，且不表达对9a-OH-AD甾体底物的1(2)-脱氢酶活性的菌种。这样借助M. vaccae突变菌株的发酵，源于它对甾核降解高水平保护机制，有效地造成生物降解过程中9a-OH-AD产物高浓度积累，可与偶发分枝杆菌菌株发酵水平比肩。

本实验室长期以来建立的II级发酵直接筛选方法，已利用中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）保藏的偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）CICC 10279转化植物甾醇筛选实验研究。利用选择培养基的平板选择，从数百株斜面菌种的摇瓶筛选试验中，筛选出可以利用国产植物甾醇（来源于陕西西安瑞源生物科技有限公司）为底物，发酵降解甾醇生产9a-OH-AD产物的菌株。在筛选试验过程中，借助TLC方法可方便有效地定性监测菌株对植物甾醇作为底物的发酵降解过程，侧链结构被切断，保留有用甾体中间体9a-OH-AD的转化反应历程。经过半微量制备实验，对分离获得的9a-OH-AD样品化学结构进行相关谱学数据测定（IR，¹HNMR，¹³CNMR），均与文献值一致^[11]。初步结果表明该菌株发酵转化植物甾醇主要累积9a-OH-AD筛选方法有效可行，继续深入实验研究工作正在进行之中（待发表）。   

俄罗斯Donova等^[12]报道由谷甾醇产生9a-OH-AD分枝杆菌突变菌株的研究。在这一工作中，作者应用豆甾醇的选择压力，结合传统诱变作用的合理组合，以获得能够转化豆甾醇成为9a-OH-AD的菌株。使用的亲本菌株分枝杆菌sp. Ac-1815 D诱变选育过程如下：在琼脂培养基上6/2菌株生长培养期间生长成不同类型的菌落。在谷甾醇培养基上6/2菌株继代生长培养10次后，分离到S-型菌落。获取的最好菌落产生9a-OH-AD（标示为6/2S）。借助6/2S菌株经受UV-诱变处理，菌落经由复制平板选择，筛选产生少数突变菌株，其中的6/2 -1 UV菌株呈现出最大的生产9a-OH-AD活性。它是经由在谷甾醇培养基上多代处理后选择出的高产菌株。菌株同谷甾醇保温培养3 d后， 9a-OH-AD产物积累浓度由2.7%提高到59.6%。在琼脂培养基上，6/2-1 UV菌株的生长培养，分离挑取光滑型黄色菌落，主要形成S-型菌落。由这些菌落获得的菌株在含AD/9a-OH-AD矿物盐培养基上，呈现微弱生长，甚至不生长。这些菌株均能产生9a-OH-AD，标示为分枝杆菌sp.2 -4M和VS已被收藏。

亲本菌株分枝杆菌sp. Ac-1815 D转化谷甾醇成为主要代谢产物AD，无9-OH-AD生成。但是从分析全甾体物质含量有些少许不平衡，表明由于有弱的9a-羟化酶和1（2）-脱氢酶活性，致使出现甾体骨架的去结构化。而选育的改变抗菌剂抗性的衍生菌株1815D-NaI₅₀^RGm₁₀^R（萘啶酸和庆大霉素）和Rif₁₀₀^RGm₁₀^R（利福平和庆大霉素），当其在AD或9-OH-AD作为唯一碳源时不能生长，仅仅由谷甾醇生成少量9-OH-AD。

为了能够获得转化谷甾醇成为9a-OH-AD的菌株，继续应用谷甾醇选择压力，结合传统的化学诱变剂诱变作用，对分枝杆菌用EMS和丝裂霉素C结合UV辐照处理，促使诱发突变，改变菌株在AD和/或9a-OH-AD生长特性，保持使用谷甾醇选择压力的诱变处理，选择出突变株2 -4M能够利用谷甾醇发酵降解侧链，积累9a-OH-AD作为主要产物。分枝杆菌sp诱变的结果，可诱发一些点突变，可能再生一或二个生化缺失酶活性突变株。进一步继续多代在有谷甾醇存在条件下生长培养，结果就富集培养出有9a-OH-AD产生的细菌突变体菌落。它既保留切断甾醇侧链的能力，并又能向9a-位引入羟基。在获得突变菌株具有9a-OH-AD生产能力基础上，仍然继续置于谷甾醇选择压力下 进行UV-诱变重复选择。相对而言具有较高产能（约摩尔产率50%）。

原始出发菌株1815D和（2-4M）突变株在AD或9a-OH-AD作为唯一碳源时均不能生长，也不能转化9a-OH-AD，这就是对9a-OH-AD特异性有关的甾体1(2)-脱氢酶缺失的证据，它直接涉及9a-羟功能基与裂解甾体化合物骨架结构有关。

突变株2-4M降解ADD是因为其9a-羟化酶活性。在仅用ADD去结构试验中，1-位烯键被氢化还原为AD，然后AD被9a-羟化为9a-OH-AD。这种1-烯-还原酶高活性已经由1815D亲株所报道。

利用分枝杆菌2 -4M对谷甾醇转化的精细测定表明，9a-羟基化发生在甾醇降解物的早期阶段。M.roseum对谷甾醇转化期间，发酵液中积累部分侧链降解9a-羟基化产物已有报道^[14]。红球菌（R.erythropolis）在酮型甾体Stenone羟化期间，就提出一组分酮型甾体9a-羟化酶—KshB蛋白参与该过程^[15]生成9a-OH-Stenone和带有C₁₇侧链的9(10)-开环酚，即带有C₁₇侧链9a-羟化甾体结构已经裂解，并伴有数种付产物生成。因此，与通常报道由谷甾醇首先产生AD，接着9a-羟化产生9-OH-AD的见解不同，生成9-OH-AD主要是带有C₁₇侧链9a-羟基化甾体继续降解到C₁₇-酮为止。这与分枝杆菌 2-4M不适合作为外源性AD底物的事实相符合，即使在低底物浓度下（0.25 g/L），转化AD为9-OH-AD仅有低于7%转化率。与此同时当谷甾醇底物浓度达到5 g/L，却观测到了50% 9a-OH-AD摩尔产率，即使谷甾醇在长期保温转化期间也未见有AD生成9a-OH-AD。

分枝杆菌 2 -4M菌株同谷甾醇的保温转化，生成9a-羟化物和非羟化代谢物比率偏向前者。在静止期，9a-羟化甾体化合物稳定在最高水平，这就证实9a-羟基化的不可逆性。虽然尚未见生成9a-羟基谷甾醇或9a-羟基-谷甾醇-3-酮产物的证据，但是保留侧链甾体的羟基化仍不可能完全排除。

由此可见，经由多代的谷甾醇压力组合突变选择，这是获得9a-OH-AD产生菌株一种有效的方法。

2． 菌种相关的细胞生理，酶学性质和生物催化过程

从细胞生理学角度分析，AD和ADD的代谢解毒作用是9a-羟化酶增加的原因之一，即这种定向进化是在若干代培养过程中自发选择的结果。AD(D)呈现出对活细胞生存能力在生长培养和呼吸作用方面的抑制作用，并抑制分枝杆菌甾醇转化活性。基于此，借助吸附树脂（XAD，Amberlite EP-60等）从转化反应混合物中吸附移走ADD，有利于甾醇降解过程的进行。这可以降低ADD对分枝杆菌降解作用的抑制效应。而AD能抑制呼吸活力、葡萄糖摄入以及抑制酿酒酵母生长。外源AD还可抑制粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）生长，影响细胞分裂，刺激形成非正常的膨大细胞。

Egorova等报道使用分枝杆菌突变株产生AD的研究。甾醇侧链氧化是一个具有复杂调控机制多酶体系作用过程。分枝杆菌对AD能进一步由其甾体9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶修饰其化学结构，生成化学上不稳定的9a-OH-ADD。该化合物同时经受非酶促A环芳构化，伴随着B环的开裂，生成9(10)-开环化合物，经由进一步已知分解代谢途径成为CO₂和H₂O（图2）。分枝杆菌对AD的酶法修饰究竟是9a-羟基化反应优先还是1(2)-脱氢反应优先？这取决于各别菌株反应特异性。对偶发分枝杆菌而言，有两种不同的3-酮甾体-1,2-脱氢酶—SDH₁和SDH₂，分别催化AD的1,2-脱氢（AD→ADD）和9a-OH-AD的1,2-脱氢（9a-OH-ADD）。显然，当其涉及同甾核氧化有关的关键酶反应活性被抑制，或者抑制9a-羟化酶和1,2-脱氢酶的合成，那么AD就作为主要产物积累。

图2. 分枝杆菌spp.生物转化谷甾醇代谢途径示意图

Fig.2  Sitosterol transformation by Mycobacterium spp.  1-9a-hydroxylase,2-3-ketosteroid1,2-dehydrogenase, 3-3-ketosteroid 1,2-dehydrogenase 2,4-1-enesteroid reductase, 5-17-b-hydroxysteroid dehydrogenase.

已报道由甾醇产生AD的分枝杆菌有NRRL B-3805，VKMAc-1815D，NRRL B-3683等。对于分枝杆菌转化甾醇而言，合理的选择手段是对抗生素的抗性，抗菌剂常被用作表型标记，以及対亲脂性化合物转化似乎都依赖同样的因子。分枝杆菌独特的细胞壁组成，使其具有高的疏水性和相对低的可渗透性，当使用万古霉素或甘氨酸抑制细胞壁肽聚糖的合成时，能够强化谷甾醇转化为AD(D)。

可见细胞壁组成不仅是影响分枝杆菌抗生素抗性和甾醇转化活性的因素，也依赖于细胞壁的可渗透性，切断甾醇侧链与甾核氧化酶活性相关。

腐生分枝杆菌NRRL B-3685可较活跃转化植物甾醇为AD源于它对利福平抗性的改变。在经用甲基磺酸甲烷（MMS）处理，获得的突变株对12种抗菌剂表征，结果有敏感性改变，保留切断甾醇侧链能力。有1菌株甾体1(2)-脱氢酶为负，积累AD作为主要的甾醇氧化产物，并还能转化AD为睾丸酮，转化ADD为AD。分枝杆菌VKMAc-1815D能切断甾醇侧链，产生AD作为主要产物，摩尔产率达到63-68%。纯系菌株的选择是建立在改变抗菌剂抗性方法学基础上，借助EMS或丝裂霉素C处理，获得的突变株保留有由谷甾醇生产AD的能力，摩尔产率达到70-75%，也可经由AD的C₁₇-酮基还原生产睾丸酮。

经由分枝杆菌甾醇侧链降解过程分析表明，通常伴随有17b-还原3,17-二酮甾体，如AD被还原为17-羟基雄甾-4-烯-3-酮化合物（睾丸酮）。该调控机制在甾醇工业生产AD(D)工艺过程中，为了避免作为副产物生成睾丸酮和1(2)-脱氢睾丸酮而具有重要性。另一方面，17b-还原3,17-二酮甾体在利用分枝杆菌由甾醇降解过程，作为睾丸酮生产工艺关键反应而具有特别重要意义[19]。因此，针对不同的研制目标，可定向设计菌种的选择和匹配优化的相关转化工艺参数，达到技术可行经济合理生产甾体激素药物。

有关分枝杆菌VKMAc-1817D发酵谷甾醇生成9a-OH-AD过程中，由于伴随有甾体-1-位脱氢酶（St₁DH）活性，引起甾体产物9a-OH-AD的去结构降解。该活性可能由AD诱导。经用抑制剂破碎细胞时，仅只有在人工电子受体—PMS（酚嗪甲基硫酸酯）存在时表现有脱氢酶活性，而整细胞St₁DH活性不存在PMS的影响。这就提示电子传递经过呼吸链到氧并不是限速步骤。由整细胞和破碎细胞9a-OH-AD的V_max的显著差别表明，整细胞中酶底物可能有受纳限制问题。由AD仅生成ADD也说明分枝杆菌 VKMAc存在St1-DH活性。同9a-OH-AD比较，AD在水中溶解度低30倍，相应地当ADD浓度超过它的溶解度时，有较低的1(2)-脱氢速率。这一事实可归因于晶体增溶作用对生物转化的限制，同时当甾体浓度没有超过其在水中的溶解度时，观察到细胞制剂St1-DH 活性对9a-OH-AD和AD有可比较的水平，类似的结果也由偶发分枝杆菌ATCC6842所报道。

野生菌株St1DH主要都是可诱导酶。通常3-酮甾体作为St1DH的诱导剂，然而以3b-羟基甾体作为诱导剂则没有诱导效应。在诱导剂中，报道了9a-OH-3-酮甾体同非羟化甾体的诱导作用。偶发分枝杆菌野生型ATCC6842彻底代谢谷甾醇为CO₂和水，而其突变株HA-1已报道两种不同的St1DH活性：其中一种酶由非羟化物诱导，另一种由9a-羟化类似物诱导。对分枝杆菌突变株报道了改变酶的可诱导性。当偶发分枝杆菌NRRL8153在生长培养时有谷甾醇存在，诱导出对9a-OH-AD的St1DH活性^[22]。我们推断当谷甾醇由Ac-1817D转化为9a-OH-AD期间，可能借助于谷甾醇氧化中间体诱导St1DH活性。这些化合物被鉴定为带有部分被降解侧链的9a-OH-3-酮甾体，类似于VKMAc-1817D突变株报道的结果。但是，对分枝杆菌VKMAc-1817D而言，既未见谷甾醇也未见谷甾醇氧化的9a-OH-3-酮甾体中间体诱导St1DH活性，反而仅观察到了AD的诱导效应。可以看出，甾醇生物降解的整细胞生物催化过程有关酶的诱导是比较复杂的，存在着宽泛的实验研究范围。

3. 相关酶的细胞定位及生物反应器

俄罗斯学者Sukhodolskaya等报道利用分枝杆菌VKMAc-1817D由谷甾醇产生9a-OH-AD的St1DH研究工作，确定St1DH主要定位在胞液里，在胞外和膜结合部位只检测到少许活性。已经报道不同的细菌在胞液和膜结合处St1DH的存在，也有膜结合St1DH部分增溶的情况，也还证明该菌株胞外St1DH同其他甾体转化活性共存的现象。采用硫胺分步沉淀，DEAE-葡聚糖和苯基葡聚糖离子交换层析，结合Bio-Gel A -0.5M凝胶过滤，对该St1DH进行部分纯化达28倍，酶分子量58000±2000Da，同已经报道的诺卡氏菌（N.coralline）St1DH 60.5 KDa，红球菌（R .erythropolis）56KDa比较，酶分子量均都在该范围内。但Ac-1817D的双亚基酶不同于诺卡氏菌分离的单体St1DH。所获得的这些St1DH的不同数据，对于改进利用谷甾醇生产9a-OH-AD的生物技术方法和细胞的生物催化性质是有参考价值的。

保加利亚Angelova等发表了利用红球菌静息细胞对AD的9a-羟基化研究结果。9a-羟基甾体化合物在合成高效抗炎药物，如9a-氟氢化可的松是很有用的中间体。它们可经由微生物区域选择性地在C₉-位引入羟基，并有若干种属的微生物具有这种转化能力。通常的方法是甾体底物与微生物一起保温培养。然而因为不可能改变细胞密度，加之转化发酵培养介质的高度复杂性，这就成为提高该工艺过程效率的限制因子。此外，有证据表明微生物的生长和甾体羟基化反应之间存在着对还原（力）辅因子的竞争问题。

在生物反应器研究中，使用事先生长培养好的静息细胞具有降低转化期间染菌风险，有利于反应产物的分离纯化等优点，是一条改进转化工艺的有效途径。已有报道借助静息细胞进行甾体化合物9a-羟基化研究产物形成动力学过程，以及借助红球菌静息细胞在营养缺陷缓冲液介质体系中由AD转化为9a-OH-AD的过程，如碳、氮源，生长菌龄和生物质贮存期对微生物9a-羟基化AD的影响，以及不同的pH，多种载体溶媒对甾体投料方式等转化条件进行了考察。观察到使用静息细胞在含有葡萄糖和非脱水酪蛋白水解物培养基中，转化率约为75%，发现氮源对工艺过程有强烈影响生长的效应，若干种醇类可增高底物转化率到85%，贮藏细胞转化能力的降低同贮存时间的对数函数有关。

总之，在所有积累9a-OH-AD研究中，都一致发现9a-OH-AD在微生物对AD去结构化代谢途径中是一种重要中间体，其中两种酶起了关键作用：9a-甾体羟化酶和D¹-甾体脱氢酶。两者同时起作用造成生成不稳定化合物9a-羟基-1,4-雄甾-二烯-3,17-二酮（9a-OH-ADD），它很快被降解成9,10-开环-酚型，甾体结构B环被开环。还有一种过程就是生成的9a-OH-ADD可经由C₁-位还原为AD而积累9a-OH-AD。即先经由AD的C₁-位脱氢，后9a-羟基化；以及AD的先9a-羟基化，生成9a-OH-AD，后C₁-位脱氢生成9a-OH-ADD 。故可推断它的9a-羟基化是以这两种方式完成。

4.        发酵工艺选择和甾醇原料合理利用

4.1 工艺方法选择

迄今为止，存在两条途径获得9a-OH-AD产品。其一，两步发酵法，即首先经由分枝杆菌对甾醇（谷甾醇、胆甾醇）发酵断侧链，生产AD；再使用其它的微生物（例如诺卡氏菌、棒杆菌及红球菌属）对AD再进行9a-羟基化。其二，利用微生物分枝杆菌突变株一步法直接发酵甾醇，生产目标产物9a-OH-AD。例如，一株分离自土壤样品的分枝杆菌属亲株，其球形原生质体经诱变处理后，选择出一株突变株M.roseum，该突变株在系统分类学上区别于已知的甾醇降解分枝杆菌，能高活力地由甾醇产生9a-OH-AD。通常菌株在缺失3-酮甾体-1(2)-脱氢酶的背景下，才可能作为主要代谢产物积累9a-OH-AD。分枝杆菌B-8119和其后的M.vccae均证实了分枝杆菌在甾醇转化中存在两种截然不同的酶与3,17-二酮甾体1(2)-脱氢作用有关，它们二者的差别在于对AD和9a-OH-AD的专一性。

已经报道红球菌SQ存在2种3-酮甾体1(2)-脱氢酶同功酶，对它编码3-酮甾体9a-羟化酶基因进行了鉴定和表征，说明它由KshA和KshB酶蛋白组成的IA类别的单加氧酶。当用KshA基因缺失突变体（RG₂）进行甾醇转化，没有发现积累AD、ADD或其它代谢物，最终代谢为CO₂和H₂O。这就解释了甾环结构降解酶（9a-羟化酶）活性。KshB基因缺失突变株（RG₄）不能切断甾醇侧链，表明甾醇侧链降解中9a-羟化酶组分可能起的作用。

4.2 有机溶剂介质中的双相转化

近年Angelova等报道在有机相介质中红球菌细胞对AD的羟基化。加入到与水不混溶的有机溶剂介质中的甾体化合物微生物转化，已被证明是克服水基反应介质甾体底物溶解度低，从而改进工艺过程有效性的一条合适途径。有机-水相转化介质已被成功地应用于谷甾醇侧链降解和6a-甲基-氢化可的松-21-醋酸酯的脱氢。早期有文献报道棕曲霉（A.　ochraceus）对孕甾酮的11a-羟基化存在与水不混溶有机溶剂体系中丧失活性，可见有机溶剂对微生物甾体羟基化的破坏作用。但尚未见进行微生物9a-羟基化在与水不混溶有机溶剂介质中的可应用性研究报道。

作者利用红球菌静息细胞应用有机溶剂介质体系，对AD的9a-羟基化进行了评估。重要的是该红球菌细胞9a-羟基化和D¹-甾体脱氢活性两者均是可诱导的，而且他们的诱导过程发生在C/N缺陷转化介质中并是连贯进行，D¹-甾体脱氢酶合成在先，继之是9a-甾体羟化酶的合成。这样，羟化反应的效率可能因为阻断不需要的D¹-甾体脱氢酶活性已经以近似化学计量值升高。在一邻苯二甲酸酯-缓冲液双相转化介质（3:1，v/v），含有AD  1g/L底物浓度下，得到产物产率高于90%。该结果提示：在该条件下D¹-甾体脱氢活性基本上被抑制，羟化反应产物较好产率超过60%以上，同时也在一邻苯二甲酸酯培养基中，伴之以高通气条件下，且最低水含量维持在大约3%（v/v）条件下发生反应。而在这种单相邻苯二甲酸酯培养介质获得的结果，凸显出红球菌静息细胞在建立9a-羟基化和D¹-脱氢活性方面通气参数重要性。因为在一带水夹套反应器的对照实验中，加入的AD不通气，仅用饱和空气的水相进行操作，结果加入的AD没有任何变化。这种单相介质有关通气效应对于微生物细胞甾体转化依赖关系此前在分枝杆菌细胞已有报道。应该强调指出：在该邻苯二甲酸酯介质中对AD转化时程曲线的研究，发现它非常类似于先前在水相介质中得到的结果。最明显的差别在于有机相介质中对数生长期长于水相介质中的对数生长期。很可能是AD在有机溶剂中的增溶作用，降低底物-细胞直接接触而减少对AD初始摄入速率的结果。有机相反应介质中估测转化反应速率同水相介质相比较大约高6倍，对这一现象说明由于有机相介质中AD的增溶作用，可能促进从细胞内排出羟化产物。

在纯有机相介质中，还发现可经由非诱导静息细胞进行有效的甾体羟基化。正如先前讨论过细胞甾体转化能力的诱导是一个适应过程，并伴随着通过增加胞外蛋白周转，包括选择性降解的酶系，这些酶系对细胞并非必需，且对这种变化的环境导致新酶的合成。可见，当其在水相和有机溶剂介质中进行羟基化反应获得有可比较结果，意味着即使在单相邻苯二甲酸酯介质中，红球菌静息细胞不仅保留了如分枝杆菌细胞在同样条件下同样的活力，而且也还能重新合成整个酶系。该酶系正是满足雄烷甾体化合物作为单一碳源能源生理代谢的需求。该文提出的实验结果证实了文献有关可借助制备的仓贮细胞改进微生物羟化工艺并充分满足增加甾体化合物在介质中的溶解度需求这一设想。

4.3甾醇原料选择

Donova等还报道有关甾醇原料选择可行性的研究工作—含有甾醇的大豆油生产废料微生物转化研究。大豆提取残留物是一种豆油生产的废料，对它作为初级原料生产C₁₇-酮甾体的可行性进行了研究。发现利用分枝杆菌sp.1817D在较长的转化期间（300-350h）生物转化很慢，检测不出甾体产物。于是对这种废料中含量达14%可转化甾醇（谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇）混和物进行预处理。借助微生物富集培养技术，从废料样品中分离野生型微生物菌株，它较分枝杆菌能更有效地利用其中的非甾醇组分，从而富集甾醇底物。借助极性有机溶剂化学预处理消除废物样品中的非甾醇杂质组分，可提高生物转化速率和9a-OH-AD的摩尔产率，可与来源于高质量商业妥尔油谷甾醇相当。在  10 g/L可转化甾醇制剂经由分枝杆菌1817D，60　h转化期间达到65% 9a-OH-AD摩尔产率。这就说明大豆油工业生产废弃物，欲要作为工业生物技术生产C₁₇-酮甾体化合物价廉底物使用，可以事先对其进行预处理。

甾体药物工业生产每年对天然甾醇有千吨级的需求量因此存在着日益增长的对含甾醇原料价廉物美易得的市场需求。

利用微生物断天然甾醇侧链是获得C₁₇-酮甾体的基本手段，C₁₇-酮甾体是合成各种各样甾体化合物关键前体，包括性激素、糖皮质激素、利尿剂等。C₁₇-酮甾体的生产估计每年为1000 t，超过60%基本化合物均都经由生物技术工艺进行生产。在天然甾醇中，b-谷甾醇和胆固醇是最适合经由微生物转化用于生产C₁₇-酮甾体产品。

胆固醇具有良好的特性，适用于微生物侧链氧化的底物，但是胆固醇生产C₁₇-酮甾体原料成本较高，与b-谷甾醇相比，其利用程度较低。

b-谷甾醇是一种广泛分布的植物甾醇，作为单一化合物的生产是比较昂贵的，而通常使用一种可用于微生物发酵转化甾醇混合物——俗称“植物甾醇”^[5]，这是高等维管束植物经主代谢途径生物合成，分布存在于相关组织细胞的甾醇化合物。工业生产加工中凡是使用植物性原料的纸浆和造纸工业，植物油工业，蔗糖工业废物等，均可作为富含植物甾醇原料资源化开发，显然具有生物炼制重要意义。

“甾醇组分”是决定C₁₇-酮甾体产品价格的主要因素之一，因而降低成本是必要的。从纸浆和造纸工业废弃物、妥尔油产物的中性及精选中性组分，在没有分离和纯化植物甾醇条件下，已经尝试直接用于获得C₁₇-酮甾体（AD、ADD）。

葡萄牙的纸浆厂和食用油生产厂已经调查富含不同甾醇的废料可用于生物转化可行性。来自纸厂妥尔油馏出物和来自食用油脱臭物（食用油精炼工艺废弃物）富含甾醇部分（>96%）可以达到70%的产率。利用分枝杆菌NRRL3805转化为AD和ADD，最好的结果来自转化富含妥尔油甾醇未皂化分离物，终产物（AD+ADD）的摩尔产率在底物负荷2.5mmol/L时为55%；而食用油脱臭物甾醇转化产率较低是因为这些分离物中有较高的豆甾醇含量所致的抑制效应^[5]，看来还是有必要从植物甾醇中分离出有多种用途的豆甾醇。

5.  结语

在世界范围内，传统上作为甾体激素药物半合成原料—薯蓣皂素，伴随着其资源的短缺，作为替代薯蓣皂素有效工业生物技术产品已经在德美问世，即微生物发酵断植物甾醇侧链生产AD，ADD，产能已达每年千吨级水平并成功用于避孕性激素药以及皮质激素的生产。本文重点介绍了国外近年来已经形成研究与开发热点基础工作—分枝杆菌突变株是如何经由谷甾醇选择压力，结合抗生素抗性选择及UV诱变，在多代的半连续培养过程中最终选择出产生9a-OH-AD（合成高效含卤抗炎皮质激素很有用中间体）的突变菌株，并结合分枝杆菌代谢降解植物甾醇过程中积累17-酮甾体，即AD，ADD，9a-OH-AD等的消涨关系，相关的细胞生理，酶学性质，生物降解工艺过程，以及植源性甾醇原料富集选择等R&D问题。显然，这对我国实现甾体激素药物半合成原料多元化，对业已起步的植物甾醇微生物发酵断侧链工业生产AD（D），深入开发9a-OH-AD的生物制造技术具有参考价值。

（本文缩编自《生物加工过程》，2010，8（5）：69-77）