摘 要：该实验以钠他霉素为菌种进行一系列的发酵，通过其单因素实验和正交实验，来确定了其最佳的培养基配方及发酵条件:葡萄糖3.5%，大豆蛋白胨1.85%，酵母粉0.40%，初始pH值7.0，接种3%，50mL放入的250mL的三角瓶中，25℃，转速300r/min，发酵120h。最终在此配方和发酵条件下，纳他霉素产量可达到1.2g/L。
关键字：纳他霉素 培养基 发酵优化
前言
纳他霉素（Natamycin），也称游链霉素，是一种天然的多烯大环内酯类抗生素[1]。它是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces Natalensis）经过发酵得到的一种次级代谢产物，能够有效抑制酵母菌和丝状真菌的生长及真菌毒素的产生，作为一种无毒害、低剂量的生物防腐剂，已被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗[2]。目前，国际上已许可使用的生物防腐剂仅为乳酸链球菌素（Nisin）、纳他霉素（Natamycin）及聚赖氨酸（ε-poly-lysine）三种[3]。我国目前允许使用的仅为乳酸链球菌素和纳他霉素。钠他霉素作为一种新型的防腐剂，因为有其高效的杀菌效果以及无毒无害的安全保证，因此被各个行业所亲睐[4]。近几年在全球经济的发展迅速，人们的生活水平普遍提高了，因此对那些无毒无害的食品越来越亲睐，从而促进了各个行业开始寻找这种防腐剂。又因为钠他霉素高效的杀菌效果以及无毒无害的安全， 所以钠他霉素就孕育而生。目前有30 多个国家已经将钠他霉素作为天然食品添加剂和防腐剂使用。
1 材料与方法
1．1材料
1.1．1菌种
生产菌株:褐黄抱链霉菌S.giLvosPoreus，ATCC13326。
1.1.2主要药品
无水葡萄糖 分析纯 上海生工生物工程有限公司
麦芽浸粉 RT 天津市化学试剂一厂
琼脂粉 生化试剂 大五化学株式公社
牛肉蛋白胨 微生物培养基用 北京化学试剂公司
大豆蛋白胨 生化试剂 北京市海淀区微生物培养基制品厂
酵母浸粉 生化试剂 成都市彭县丽春化学厂
糊精 分析纯 北京市海淀区微生物培养基制品厂
可溶性淀粉 分析纯 天津市化学试剂批发部经销
麦芽糖 生化试剂 天津市化学试剂一厂
蔗糖 分析纯 天津化学试剂批发部监制
氯化钠 分析纯 天津市化学试剂一厂
MgSO4 分析纯 天津市塘沽化学试剂厂
HCl 分析纯 天津化学试剂部监制
磷酸 分析纯 天津化学试剂三厂
1.1.3主要仪器
LDS一10型离心机 上海安亭科学仪器厂
TGL一16B高速台式离心机 北京医用离心机厂
电热恒温培养箱 湖北省黄石市医疗器械厂
DFG801型电热鼓风机 天津式实验仪器厂
HKCB一3型恒控磁力搅拌器 格兰仕
电子分析天平 瑞士
超纯水器 北京普析通用仪器有限责任公司
微波炉 温州市医疗电器厂
超净工作台苏 州净化设备厂
1.1.4培养基
活化液体培养基(g/L):葡萄糖15克 蛋白胨5克 麦芽浸粉8克 酵母粉7克 PH7.0
斜面保存培养基(g/L):葡萄糖15克 酵母粉4克 蛋白胨5克 琼脂粉10克 麦芽浸粉2克 PH7.O
分离培养基(g/L) :葡萄糖20克 蛋白胨5克 酵母粉3克 麦芽浸粉2克
琼脂粉10克 PH7.0
种子培养基(g/L):葡萄糖20克 蛋白胨6克 酵母粉4克 NaCl8克 PH 7.0
发酵培养基(g几):大豆蛋白分离物20克 酵母粉3克 PH 7.0
葡萄糖(50%葡萄糖单独灭菌)7克
以上培养基灭菌条件:115℃，灭菌30min
1.2 试验方法
1.2.1 菌种的活化
从锥形瓶中接种一环装有10mL液体的活化培养基接种于25OmL的三角瓶中，于25℃，300r/min振荡培养48h，转接于保藏斜面，25℃恒温培养120h，当斜面几乎完全被孢子覆盖，这事放入冰箱(4℃)中保存以备用。
1.2.2 菌种的分离
取0.3ml孢子悬浮液接种于装有20ml培养基的平板上，连涂5块平板，25℃恒温培养120h。然后根据菌落的形态，大小等因素来挑选不同典型形态的单菌落，用D=10mm的打孔器打10个孔，将单菌落琼脂块放入D=100mm的培养皿中，并将平板于25℃恒温培养24h，当发现边缘出现清晰的抑菌圈时，这时就用抗生素效价仪测定抑菌圈得大小[5]。挑选抑菌圈较大的菌落并转接于保藏斜面，25℃恒温培养120h。
1.2.3种子培养
吸取5ml孢子悬浮液接种于装有50ml的种子培养基的250mL三角瓶中，25℃，300r/min振荡培养48h，使菌体能迅速到达生长期。
1.2.4摇瓶发酵培养
以3%的接种量接种种子液到装有50ml的液量的250ml三角瓶中，25℃、300r/min回转式摇床发酵120h。
1.2.5 生产菌的测定-干重法[6]
首先先将滤纸放于100℃的烘箱下烘至恒重，称重后并记下数据然后在放入布氏漏斗。取10ml的发酵液，3000r/min离心30min，把上面的清液倒掉收集其沉淀，用无菌水洗涤两次，将洗涤后的沉淀洗入布氏漏斗中抽滤，将滤纸和菌体在50℃的烘箱中干燥至恒重，称量并计算菌体的干重。
2结果与讨论
2．1培养基的优化
2.1.1种子培养基的优化
表1 种子培养基（g/100ml）
种子培养基 1# 2# 3#
生长状况 比较差 一般 最好
由上表可以看出#3种子培养基配方能使种子液的菌丝浓度更高，生长状态更好。因此将种子培养基确定为:淀粉1.0%，酪蛋白陈0.6%，玉米浆0.6%，葡萄糖1.0%，黄豆饼粉1.0%，七水硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，碳酸钙0.5%,氯化钠0.2%，pH7.0。
2.1.2斜面培养基的优化
斜面培养基的优化，主要是考察了碳源、氮源等因素对纳他霉素生产菌抱子生长的影响。初始斜面培养基配方为:葡萄糖1.0%，酵母抽提物0.3%，麦芽抽提物1.0%，琼脂0.5%，pH7.0。在该培养基上培养时发现菌落长得不够厚密，而且孢子的量也比较少，为了得到更多的孢子因而设计了以下六种斜面培养基进行试验从而得出最合理的。
表2斜面培养基（g/100ml）
培养基 1# 2# 3# 4# 5# 6#
生长状况 几乎没有 几乎没有 生长一般 生长一般 比较好 更浓更好
从上表可以得出加入可溶性淀粉和黄豆饼粉的斜面培养基上的孢子生长情况明显好转，且6#配方的培养基，其孢子生长情况是最好，因此最终确定的培养基的配方为:淀粉1.0%，葡萄糖1.0%，黄豆饼粉1.0%，酵母抽提物0.3%，麦芽抽提物0.3%，七水硫酸镁0.1%， NaCl0.2%，CaCO30.3%，琼脂2.0%，pH.70。斜面置于25℃的生化培养箱中培养5天。
2．2发酵条件的优化
2.2.1 接种量对发酵结果的影响
图3初始接种对钠他霉素产量的影响
上图可以得出当接种量从3%增加到12%时，纳他霉素产量也急剧增加，接种量为12%的产量是接种量为2%时的4倍；之后，当继续增大菌种的接种量时，纳他霉素产量反而迅速下降；当菌种的接种量为20%时，纳他霉素的产量几乎减少了60%左右。在接种量3%-12%时菌体干重的变化不是很大，大约维持在30.0g/L左右；但是随着接种量的增加，菌体干重反而却下降，大约为20.0g/L。由上图又可以得出随着接种量的增加，糖的利用率出现了先增加后减少的变化，当接种量为12%时，糖的利用率最高，达到90%以上。
2.2.2溶氧对发酵的影响
图4 溶氧量对那钠霉素产量的影响
从上面第一幅图可以得出，装液量的多少对产物合成显著的影响，当装液量由10ml增大到30ml时，而纳他霉素的产量将近增加了70.2%；这时若继续增大装液量时，纳他霉素的产量反而开始下降；当装液量为50ml时纳他霉素产量达到最小值。制假丝菌素(cnaddiin)、白六烯菌素(cnadihxeni)和杀假丝菌素(cnadicidin)等多烯大环内酷类抗生素的生物合成均对氧气的浓度比较敏感。当装液量为10-30ml时，装液量对菌体生长几乎没有什么影响，菌体干重大约在35g/L，但是当装液量增大到50mL时，菌体干重反而下降到最小值，为20g/L。从上图又可以看出糖的利用率随是随着装液量的增加(即溶氧浓度的减少)表现出先增加后减少的现象。当装液量为30ml时，消耗率几乎接近100%，而装液量为50ml时，消耗率却仅有50%左右，这可能是因为装液量过多，从而导致溶氧浓度迅速下降的原因，当发酵液中的溶氧浓度降至临界氧浓度以下时，这时就发现糖代谢受到了明显的影响。从第二个图可以得出，YP/X和YP/S都是随装液量的增多而表现为先增加后减少的变化趋势；当装液量为25mL时，YP/X和YP/S达到最大值，分别为1.98%和.067%；但是之后如果继续增加装液量，他们都开始表现出显著的下降，当装液量为35ml-55ml时，YP/X和YP/S变化不大，分别大约在0.671%和0.235%。
2.2.3 发酵温度对其影响
图5 温度对那钠霉素产量的影响
从上面的第一幅图可以得出温度对纳他霉素合成的影响比对菌体生长的影响更为明显，且有一个最适宜的合成温度和最适宜的生长温度。在一个合适的范围之内如果温度越低纳他霉素的产量随就越高，在20℃时达到最大值，为1.0g/L。当温度由20℃升高到25℃，菌体干重比刚开始时增大了20.2%，这可能是因为温度上升使得与菌体生长有关的酶促加快了反应速度而引起的；但是温度过高，酶的失活速度却加快。因此，在25℃一30℃的范围之内，菌体干重开始下降。糖利用率在20℃、25℃下均维持在80%以上，但是之后随着温度的升高却出现了明显下降；当温度升高到30℃时达到最小值，为34.5%。而又从第二图可得出，当温度在28-34℃时，YP/X和YP/S随温度降低都反而略有增加，但是当温度下降到25℃时，YP/X和YP/S开始快速的增加并达到最大值，分别为3.816%和0.595%。
2.2.4发酵培养基中碳源对发酵的影响
表6初始碳源对钠他霉素产量的影响
纳他霉素是典型的微生物次级代谢产物，在次级代谢中存在两个生理阶段，即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段[7]。在菌体生长阶段，快速利用的碳源如葡萄糖等的分解产物，阻遏了次级代谢酶系的合成，只有当这类限制因素耗尽或消耗到一定量时，阻遏作用被解除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段[8]。由上图可以得出，葡萄糖是一种能快速利用的碳源，是菌体生长良好的碳源和能源。但是如果初始葡萄糖浓度过高，就会使产生分解代谢物阻遏的作用，从而就会促进代谢大量的合成菌体，最终抑制了次级代谢产物的合成，反而明显的降低纳他霉素产量。但是另一面碳源浓度如果过低，使菌体生长所需的能量供应不足，就不能产生足够的纳他霉素的菌体，最终影响了抗生素生产。实验可得出，最合适的初始葡萄糖浓度选择在2%。
2.2.5 发酵培养中ph对发酵的影响
将发酵的培养基用酸碱调节其初始pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，目的是研究培养基的酸碱度对纳他霉素产量的影响，由a图可以得出，产物合成的最适pH值为6.0- 8.0，而此时纳他霉素产量接近1.5g/L。当pH的初始值5.0-7.0，菌体干重达到最大值，大约在30g/L以左右；而当发酵过程中菌体对糖的利用在发酵液的初始pH中性及偏碱的条件下达到最大值，大约在90%左右；但是当初始pH值为酸性条件下时，糖的利用率却不足70%。从b图可以看出，YP/X和YP/S在初始pH为7.0时达到最大值，大约为0.35%，而在初始pH为6.0时达到最大值，为.056%。所以纳他霉素的发酵的最适初始pH值为6.0-8.0。
图7 初始ph对那他霉素产量的影响
a图
b图
2.2.6 正交实验确定最佳的发醉工艺
由于发酵培养基各成分之间必然存在一定的内在关系，发酵条件之间也可能会互相的影响，因此各种最优单因素的组合并不一定就能获得最佳的发酵结果，因此需要用正交实验来设计正交表来科学地分析，从而使实验各因素之间均衡搭配，最终得到最优的发酵工艺。该实验以单因素实验结果为基础，分别选取了总氮、发酵液初始pH值和溶解氧为考察因素，每个因素取3个水平，选用L9(34)正交表，结果用抑菌圈直径的大小来衡量实验结果的好坏。
表8发酵配方的优化
由方差分析检验结果可以得出，发酵培养基的初始总氮显著最强，而发酵培养基的初始pH值及溶解氧都为显著性因素，因此显著性关系依次为A>B>C，从而最终确定了纳他霉素发酵最优工艺条件为A2B2C1，即发酵培养基初始总氮为2.2%(大豆蛋白脉1.80%，酵母粉0.30%)，初始pH值为7.0，溶解氧为250mL三角瓶装液量50mL，转速固定在30Or/min。
3 结论
3.1通过采用琼脂块法对菌种进行初筛，然后在通过观察每个琼脂块抑菌圈直径的大小从而用来反映菌落产生的能力以及释放抗生素能力的高低，从而可以简单地排除低产型菌落，简化了筛选的工作，从而缩短了育种时间，这是一种简单而有效的抗生素菌种筛选方法。再通过进一步摇瓶复筛，就能筛选出性能比较稳定，产量较高的菌株[9, 10]。最终得到的摇瓶中纳他霉素产量可达15/L。
3.2 斜面抱子25℃培养120h，在冰箱(4℃)中保存的时间不超过30天。对107个/ml孢子浓度进行种子培养，种子培养液混浊且有均匀透明的细密的菌丝体微粒，微粒直径约为0.1-0.6mm。从种子转入发酵培养基时，最佳接种龄为20h一24h，接种量为3%。
3.3通过其单因素实验和正交实验，来确定了其最佳的培养基配方及发酵条件:葡萄糖3.5%，大豆蛋白胨1.85%，酵母粉0.40%，初始pH值7.0，接种3%，50mL放入的250mL的三角瓶中，25℃，转速300r/min，发酵120h。最终在此配方和发酵条件下，纳他霉素产量可达到1.2g/L。
参考文献
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