1.湖南省林业科学院；2.国家油茶工程技术研究中心
油茶CamelliaoleiferaAbel，又称茶油树、白花茶、中果油茶、茶子树等，属山茶科Theaceae山茶属CamelliaL植物是我国特有的木本食用油料树种，有2300多年的栽培和利用历史，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，与乌桕、油桐和核桃并称为我国四大木本油料植物。目前，我国油茶面积约有300万hm2，油茶籽年产量100万t左右，年产茶油约26万t，产值约110亿元。
油茶全身都是宝，叶可净化空气，绿化环境；花可观赏，作蜜源；根可保持水土，涵养水源；根皮还可入药；茎质地细密，韧性较好，可用于制作木器、农具等；种子榨取的油—茶油是一种优质食用油，不饱和脂肪酸含量高达90%以上，以油酸为主，还富含亚油酸和亚麻酸、维生素E、生育酚、角鲨烯等营养成分，被誉为“东方橄榄油”，联合国粮农组织重点推荐为健康型高级食用植物油；茶油还能通过油脂的深加工生产高级保健食用油和高级天然护肤化妆品等；油茶粕可提取茶皂素、制刨光粉和复合饲料；茶壳可提糠醛、鞣料和制活性炭等，发展油茶生产对提高我国国民经济和人民生活水平具有重大意义。
油茶粕是油茶提油后的剩余物，近年我国年产油茶粕70多t，但大多数被废弃掉或廉价出口到东南亚等国，有效资源未得到充分利用。我国钟海雁教授、邓桂兰教授等已做过相关研究证实，油茶粕通过菌种发酵，可使部分糖类、纤维素等主要成分转化成蛋白质。本研究通过优化培养基和高效发酵菌株的筛选，以达到提高油茶粕蛋白质的目的。
1材料与方法
1.1试验菌种
米曲霉、黑曲霉、葡萄汁酵母1445、热带假丝酵母1779、地衣芽孢杆菌10181、枯草芽孢杆菌（均购于湖南省微生物研究所）。
1.2试验原料
油茶粕（购于湖南农业大学油脂与蛋白质实验室），将油茶粕置于70℃电热鼓风恒温干燥箱中烘干至水分不再发生变化。
1.3试验方法
1.3.1热水脱皂
油茶粕粉碎、过筛→加3倍清水→煮沸2h（不断搅拌，以防止焦灼）→过滤，滤渣在清水中浸泡24h，反复洗涤，除去上层溶液→过滤，烘干备用。
1.3.2培养基优化
米曲霉是一类产复合酶的菌株，可分解油茶饼粕中的粗蛋白质、纤维素、糖类物质等，故试验用米曲霉初步筛选发酵培养基。以油茶粕为主，麦麸为辅，设计了4种培养基配方，见表1。以米曲霉发酵，在温度28℃下培养3d。发酵完后测定培养基中蛋白质的含量。
1.3.3配伍菌种筛选
将白地霉、黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢杆菌10181、热带假丝酵母1779及葡萄汁酵母斜面分别用无菌水洗下，30℃摇床振荡培养48h，分别接入到饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃下培养72h，观察固体平板上各菌株的生长情况，同时，测定培养基发酵前后蛋白质含量的变化。
根据各试验菌的发酵结果，选用黑曲霉为指示菌。将黑曲霉接种于优化的培养基中，28℃下培养48h后，再分别点种其他待选菌，28℃下培养72h，观察各菌株的生长情况。
1.3.4菌种比例及组合优化
根据平板点种刺激圈试验，选择与指示菌配伍的菌种两株，组成A组菌和B组菌。
（1）A组菌两菌株接种比的确定。将斜面菌种用无菌水洗下，以接种比为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接种量为10%，分别接入到三角瓶发酵饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃生化培养箱培养72h后，105℃烘干至恒重，测定其粗蛋白含量。
（2）B组菌两菌株接种比的确定方法同A组菌。
（3）4个菌种的混合比。将斜面菌种用无菌水洗下，以A组菌与B组菌的接种比分别为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接种量为10%，分别接入到三角瓶发酵饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃生化培养箱培养72h后，105℃烘干至恒重，测定其粗蛋白含量。
1.4测定方法
蛋白质含量测定：凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003）；
粗脂肪的测定：索氏抽提法；
粗纤维含量测定：重量法；
可溶性总糖测定：蒽酮法；
皂素的测定采用：比色法。
2结果与分析
2.1油茶粕化学成分分析
油茶粕的主要成分包括蛋白质、茶皂素、粗纤维、可溶性糖等。将油茶粕和热水脱皂的油茶粕进行成分测定，测定结果见表2。
从表2可以看出，两组处理蛋白质含量均为9%以上，是一种很好的饲料原料。热水脱皂后的油茶粕，水溶性物质茶皂素和可溶性糖均有所降低，分别为3.81%和2.88%，脱皂率高达79%。
2.2培养基优化
优良的培养基可以为微生物的生长提供所需的全部营养素，包括C源和N源。米曲霉是一类产复合酶的菌株，可使油茶粕中的粗蛋白质、纤维素、糖类物质分解中微生物生长所需的C源和N源，故试验用米曲霉来初步筛选发酵培养基。将米曲霉接种于4种培养基配方中，发酵前后蛋白质含量见图1。
由图1可知，各油茶粕培养基发酵后蛋白质含量均有一定的提高，提高率可达28.00%。其中，以热水脱皂后的油茶粕制备的培养基中蛋白质含量均高于相对应的以未处理的油茶粕制备的，说明油茶粕的茶皂素可以抑制微生物生长；4组培养基配方中，培养基配方Ⅱ的蛋白质提高率较培养基配方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的大，说明培养基配方Ⅱ的营养成分组成较合理，利于微生物的生长。由此可见，最佳的培养基配方为：热水脱皂的油茶粕16g、葡萄糖2g、麦麸1g、（NH4）2SO41g、水19g。
2.3配伍菌种筛选
混合菌种发酵效果优于单个菌种发酵，因混合菌种发酵可多个菌种之间互相补偿缺陷，进行协同发酵。点种各菌株处黑曲霉的生长情况见表3。
地衣芽孢杆菌10181、葡萄汁酵母1445与米曲霉可明显刺激黑曲霉生长，因此确定这3种菌为配伍菌种。
2.4菌种比例及组合优化
2.4.1双菌种接种比的确定
根据配伍菌种的筛选结果，结合黑曲霉和米曲为同一属的特性，确定地衣芽孢杆菌与黑曲霉为A组，葡萄汁酵母和米曲霉为B组，发酵确定双菌种的接种混合比。
由图2和图3可知菌组A和菌组B在接种比分别为1∶1和1∶1时粗蛋白含量最高，因此接种比为1∶1时为双菌种的最佳接种比。
2.4.2菌组接种比的确定
将菌组A和菌组B按比例接种，发酵，结果见图4。
由图4可知，在菌组A和菌组B的接种比为1∶1时，粗蛋白含量最高。可得，油茶粕生产蛋白饲料辅料的最佳接种混合比为地衣芽孢杆菌10181∶黑曲霉∶葡萄汁酵母1445∶米曲霉=1∶1∶1∶1。发酵生成的粗蛋白含量为16.94%，较未发酵时的10.82%提高了56.56%。
3结果与讨论
（1）油茶粕是榨油后的主要副产物，由残油、茶皂素、可溶性糖、蛋白质等有效成分组成，将其高效利用，可以大幅度提高油茶的综合价值。将未经处理的油茶粕和热水脱皂后的油茶粕进行各组成成分测定，两组处理蛋白质含量均为9%以上，并含可溶性糖、纤维素等可被微生物利用的物质，是一种很好的饲料原料。热水脱皂后的油茶粕，脱皂率高达79%，是一种有效的茶皂素提取方式。因此，油茶粕利用微生物法生产蛋白饲料技术与热水提取高纯度、高活性茶皂素技术有机结合以提高油茶粕的利用率可作为下一步研究重点。
（2）优良的培养基可为微生物的生长提供所需的C源、N源等营养素。以米曲霉初步筛选油茶粕发酵培养基，得出最佳配方为：热水脱皂的油茶粕16g、葡萄糖2g、麦麸1g、（NH4）2SO41g、水19g。其中，热水脱皂的油茶粕发酵效果优于较未处理的油茶粕的，因油茶粕的茶皂素抑制了微生物生长，在油茶粕利用微生物法生产蛋白饲料前必须进行脱皂素处理。
（3）油茶粕通过多菌种的协同发酵，油茶粕中的多糖、纤维素等物质高效转化成蛋白质。通过平板点种试验，确定与黑曲霉配伍的菌种为：地衣芽孢杆菌10181、葡萄汁酵母1445与米曲霉；根据三角瓶发酵培养，获得了油茶粕发酵产高蛋白的最优菌种组合及发酵比例为地衣芽孢杆菌10181∶黑曲霉∶葡萄汁酵母1445∶米曲霉=1∶1∶1∶1。发酵生成的粗蛋白含量为16.94%，较未发酵时的10.82%提高了56.56%，从而达到了提高产品的粗蛋白含量的目的。
