另附原理篇供参考：二发、苹乳发酵原理 纸层析测定的方法实例
凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。
域： 细菌域 Bacteria
门： 厚壁菌门 Firmicutes
纲： 芽孢杆菌纲 Bacilli
目： 乳杆菌目 Lactobacillales
科： 乳杆菌科 Lactobacillaceae
属： 乳杆菌属 Lactobacillus
Beijerinck 1901
模式种
Lactobacillus delbrueckii
葡萄酒的苹果酸－乳酸发酵是苹果酸在酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）的作用下转换变为乳酸的过程，简称为乳酸发酵，酒明串珠菌发酵过程中会产生强烈的像奶油、坚果、橡木等香味的物质，这些香气能很好地与葡萄酒中的水果风味相融合，增加了葡萄酒的香气复杂性。这些风味之一的奶油香气是通过乳酸菌产生的双乙酰表现出来的。
一葡萄酒的ML发酵的作用和问题
葡萄酒的苹果酸－乳酸发酵是苹果酸在酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）的作用下转换变为乳酸的过程，简称为乳酸发酵，ML发酵或MLF。ML发酵可以降低葡萄酒的酸度，改善口感，增加香气。
ML发酵是酿造优质红葡萄酒的重要措施。大多数红葡萄酒需要进行ML发酵以获得风味，香气和口感方面的提高。而ML发酵对于白葡萄酒并非是必须的工艺，除了霞多丽（Chardonney）和其他酸度高的白葡萄品种以外，白葡萄酒的酿造一般不进行ML发酵。
ML发酵可以酿造出风味优异的高级葡萄酒，很多自酿者都在积极地引入ML发酵发生。但是，ML发酵技术要求较高，处理不好会产生一些问题。主要表现在：
1 无监管的ML发酵有可能导致PH值过高，葡萄酒过早地氧化，引起细菌腐败。
2 柠檬酸在ML发酵过程中会产生醋酸。葡萄因为柠檬酸含量较少，基本不受影响。但是进行酸度平衡时如果加入柠檬酸，在ML发酵过程中就会有醋酸产生的问题。
3 ML发酵不彻底会造成陈酿过程中乳酸菌的大量繁殖，影响葡萄酒的品质。
4 从营养角度来看，进行ML发酵或许是个损失，因为苹果酸具有很高的营养价值和保健功能，而乳酸对于人的身体来说，是代谢和运动产生的疲劳物质，此外，苹果酸能够增加葡萄酒的天然水果香气。对于喜欢新鲜水果香气的酿造者，通常采取控制措施，防止ML发酵的发生。
酒类酒球菌存在于葡萄的表面，并随着压榨进入果汁，在条件适当的时候大量繁殖，因此，不管是否引导或接种乳酸菌，乳酸发酵都会自然发生地发生在所有的葡萄酒酿造过程中。自酿葡萄酒需要了解乳酸菌的特性。以便引导和控制ML发酵。
二乳酸菌的适生条件和果醪准备
1 乳酸菌对于生长条件要求是：
1 营养丰富。
2 酒精度小于10%。
3 游离SO2在10ppm以内，人工菌种可以忍耐20～50ppm的SO2。
4 生长温度约12～24oC，适宜发酵的温度18～22oC之间，12oC温度下ML发酵也可以进行，但是速度很慢。
5 乳酸菌最适生长ph值为4.2～4.5，通常需要进行ML发酵的ph值在3.1～3.5之间。
2 苹果酸－乳酸发酵的果醪准备
1 水果质量
采收的酿酒葡萄要清洁，没有腐烂变质，这样添加的游离二氧化硫可以控制在50ppm以下。如果葡萄要质量不好，添加的游离二氧化硫要超过100 ppm，乳酸菌的存活数量会很少。
2 游离二氧化硫
乳酸菌对SO2非常敏感，在启动ML发酵时，要控制SO2的含量。
自然启动的ML发酵：≤ 5 ppm
人工接种的ML发酵：≤ 20ppm
3 酸度调整
如果果醪的酸含量很低而又需要做ML发酵，则要进行酸度调整。进行ML发酵果醪的酸度调整不能使用苹果酸和柠檬酸，只能使用酒石酸。ML代谢和消耗苹果酸，导致酸度下降，失去酸度调整的意义。柠檬酸则在ML菌代谢过程中会生产醋酸。醋酸不但对ML发酵不利，并且影响酒的口味。
许多混合酸等量的混合了柠檬酸，苹果酸和酒石酸，进行ML发酵应该避免使用。
4 营养要求
1 矿物质
Mn2+，Co2+，Zn2+，Mg2+等是乳酸菌代谢所必需的矿质元素，如同酵母菌，ML菌受益于这些营养元素的补充。
2 有机营养
乳酸菌对有机营养的要求超过酵母，尤其是氨基酸、尼古丁酸和泛酸。增加核黄素，吡醇，精氨酸对于乳酸菌的生长具有促进作用。
3 细酒泥
ML发酵时最好有细酒泥，细酒泥含有的养分对乳酸菌生长起重要作用。
4 不要添加氮素。
与酵母菌不同的是乳酸菌不需要无机氮，增加铵盐有可能导致葡萄酒变咸。
三 ML发酵的引导
1 ML发酵的菌种来源
ML的菌种有两个，一个是利用野生乳酸菌，另外一个是使用人工乳酸菌种。
乳酸菌人工菌种有液体菌种和冷冻干燥菌种两种包装形式。乳酸菌的液体菌种储存时间较短。冷冻干燥的乳酸菌种，在冰箱里可以储存一年以上。自酿葡萄酒常用的冷冻干燥菌种有：
Lalvin ® 3X
是三个不同的乳酸细菌混合包装，用于难度高的ML发酵条件。
Lalvin MCW
具有优异的抗逆性，耐低温，pH值可低于3.0，酒精承受度为15％，适用于最困难的ML发酵条件。
Lalvin ® OSU
提高白葡萄酒的口感，同时保持红葡萄酒的红色。
人工乳酸菌种的价格昂贵，大约是酵母菌的8～12倍。
2 ML发酵的引导
1.1 自然发生的ML发酵
低SO2环境条件下野生乳酸菌会自然发酵。为了发酵彻底，通常是冬季把完成酒精发酵的果醪放在室内或地窖里，随着春天气温回升，温度会进入乳酸发酵适宜的范围。这个方法的缺点容易产生其他微生物的危害，影响葡萄酒的口味。
1.2 选择能够兼容ML发酵的酵母菌
有些酵母菌可以和苹果酸～乳酸菌共生，在酒精发酵的同时可以进行ML发酵。兼容ML发酵的酵母菌种包括：
酿制红葡萄酒：Lalvin RC 212或Red Star Pasteur Red
酿制白葡萄酒：LalvinICV-D-47或Red Star C?te des Blancs
1.3 人工接种的ML发酵
乳酸菌的人工接种主要有2种方法。
1 用人工乳酸菌种接种，操作方法在购买的菌种包装上有使用说明。
2 已经进行ML发酵的葡萄酒可以给没有进行ML发酵的葡萄酒接种。前提是葡萄酒ML发酵的时间要超过2个星期，接种量为1:50。加大接种量成功的可能性更高。
四乳酸菌的接种
由于人工乳酸菌种价格昂贵，为了节约成本，增加菌种数量，需要进行菌种的复水和预处理。
1 乳酸菌的复水
1 冷冻干燥菌种要先放入25～30oC的蒸馏水中进行15分钟的复水，期间轻轻搅动。
2 然后加入25ml没有防腐剂的苹果汁，排除气体，密封。
3 在室温条件下放置2～4天后加入到果醪中。
经过预处理的乳酸菌抗逆性增强，以Lalvin OSU菌种为例，可以在游离SO2大于10mg/L，温度小于16oC，PH值小于3.2，酒精含量大于12.5%的条件下使用。发酵醪的体积可以增加3～5倍。
2 乳酸菌接种的时间
1 最好的时间是在酒精发酵完全结束后。过早接种会引起酵母和乳酸菌两者之间的营养竞争和相互抑制，导致酵母发酵过早停止或者乳酸发酵不能启动。
2 对于与乳酸菌相容的酵母菌，可以在酒精发酵的同时，接种乳酸菌进行ML发酵。
3 接种方法：
1 红葡萄酒
果醪温度最好在21～24°C，或尽量接近 ML可以接受的工作温度。按照使用说明加入乳酸菌和及其营养。搅拌均匀。
2 白葡萄酒
白葡萄酒的ML发酵比红葡萄酒更加困难。由于去皮发酵营养来源不足，所以如果要进行ML发酵必须补充营养。
4 注意事项：
1 ML菌常有接种不足的危险。如果发酵初期细胞数量不够，ML菌通常不能繁殖出足够的菌群，不能完成发酵。
2 ML菌没有接种过量的危险，接种量过多只会加快完成发酵，唯一的负面影响是成本过高。
五 乳酸发酵的管理
乳酸发酵开始后，可以观察到微生物活动的迹象。典型的乳酸发酵特征是有细密的小气泡沿着瓶壁上升。人工接种的乳酸发酵一般进行3-4周，自然发生的乳酸发酵要持续1-2个月。这个期间如果管理不当，会有乳酸发酵停顿或杂菌感染的风险。乳酸发酵的管理措施如下：
1 每周轻轻的搅拌两次。要让发酵瓶底部的细酒泥完全悬浮到酒体中。
细酒泥是乳酸菌生长的营养来源。搅拌防止乳酸菌沉积在发酵瓶的底部。使得养分均匀分布，有利乳酸菌的生长。搅棒不要使用竹木制品，木材的多孔结构容易滋生杂菌。
2 温度保持在18～22°C，可以促使乳酸菌尽快完成发酵。如果< 18°C，发酵速度会放慢，这取决于菌株的生物特性和葡萄酒的其他条件。
3 尽量减少暴露空气的时间。大部分乳酸菌适于无氧或少氧条件，发酵时不能曝气，也不能倒酒。
ML发酵所产生的二氧化碳的数量远低于酒精发酵。不能依靠二氧化碳隔绝氧气，在搅动葡萄酒时，要采用密封式的搅动或加注二氧化碳。
4 加入橡木。
如果希望增加葡萄酒橡木的味道，在ML发酵时加入橡木是很好的时机。木材裂缝为微生物的生长创造了优良的环境。同时所产生的香味能够微妙地融入葡萄酒。
5 ML发酵会明显的降低PH值，在ML发酵之前和完成ML发酵以后，最好进行TA和PH值的测定和调整。这不仅是为了TA和PH值的平衡，也是为了防止高PH值条件下产生的微生物腐败。
6 适合乳酸菌生长的条件，同时也适于其他有害微生物的生长，因此在酿造葡萄酒的全过程中，都要高度重视消毒，防止杂菌滋生。
六 乳酸发酵的检测
苹果酸耗尽以后，ML发酵会自然停止。通常在ML发酵停止后要进行检测，以防ML发酵停顿造成的麻烦。检测和确定发酵完成的办法是进行色谱测试，也可以通过视觉方式帮助判断。
1 色谱测试
色谱检测是唯一准确鉴定ML发酵是否完成的办法。国外自酿使用的ML发酵的检测是纸面层析包，可以在专门的酿酒设备商店或网站购买。相关链接：纸层析测定的方法实例
2 观测判断
如果没有条件进行MF检测，可以采用以下办法：
1 倾斜发酵瓶，观察是否有细密的小气泡沿着瓶壁上升。
2 温度调整到乳酸菌适宜的范围，连续观察10天。这个期间如果没有发现小气泡， 可以认为ML发酵完成。
注意： ML发酵完成的观测判断常常出现失误。因此要加强葡萄酒的SO2管理及装瓶的稳定措施。否则，后续恢复的 ML发酵导致pH值升高，可能会出现腐败问题。
七 ML发酵的抑制和乳酸菌的清理
1 ML发酵的抑制
对于不需要进行ML发酵的葡萄酒，必须要人为地抑制ML发酵。抑制的方法有几种：
1 最有效的方法是在酒精发酵之前加入足量的SO2，在以后进行的倒酒过程中补充SO2，保持必须的浓度。
2 温度控制控制在低于ML发酵的范围。
不需要ML发酵的白葡萄酒的酒精发酵温度控制在10～14oC，防止可能出现的酵母发酵和ML发酵同时进行的情况发生。
红葡萄酒和白葡萄酒都要在10～14oC的范围内进行存储和陈酿。
3 酒精发酵使用Lalvin EC-1118 RED 或STAR Davis #796酵母。这些菌种在发酵过程中产生的SO2可以抑制ML发酵。
2 乳酸菌的清理
对于进行ML发酵的葡萄酒，在苹果酸发酵完成后，乳酸菌群体数量并不迅速下降，如果不及时采取终止措施，乳酸菌就会利用葡萄酒中的氨基酸生成生物胺，引发多种乳酸菌病害。因此在ML发酵结束后应立即对乳酸菌进行清理。
清理方法：
1 总二氧化硫浓度调到100 ppm 或游离SO2为50 ppm。可以安全地进行ML发酵结束后的葡萄酒的储存和老化。
2 酒度提高到14%以上。
3 如果低温贮存，ph值控制在3.2以下，对控制乳酸菌病害更为有利。
