朱兆香，王相晶＊＊
基金项目：教育部博士点新教师基金（No. 20092325120007）
作者简介：朱兆香，（1985 年－），女，硕士研究生在读，主要研究方向：微生物的次级代谢 通信联系人：王相晶，（1972 年－），女，博士生导师，教授，主要研究方向：微生物的次级代谢. E－mail：wangxiangjing2008＠yahoo.com.cn（东北农业大学生命科学学院5 ，哈尔滨 150030）
摘要：次级代谢物的产生过程受许多理化因素的影响，包括养分供应、氧气浓度、温度和pH 的影响。在工业发酵中可以通过控制和优化这些因素，达到提高代谢产物产量的目的。随着DNA 重组技术的日趋成熟,利用生物合成途径的遗传操做为实现代谢产物产量的提高提供了新的工具。其方法主要包括改变前体代谢通量、解除生物合成途径抑制以及过量表达代谢薄弱环节中特异性的酶。此外，生物合成基因簇在一些生物体中进行异源表达，不仅能提高生产水平，而且可以加速生产进程。
关键词：微生物学；链霉菌；代谢工程；前体工程；调控系统；异源表达
中图分类号：Q9315 The ways to enhance the production of secondarymetabolites in actinomycetes by metabolic engineeringZHU Zhaoxiang, WANG Xiangjing（Institute of Life Science,Northeast Agricultural University, Harbin 150030）
Abstract： The process of secondary metabolites was influenced by several physical and chemical20 factors ,including nutrient supply, oxygen concentration, the effects of temperature and pH. Thesefactors have been controlled and optimized in industrial fermentations in order to enhancemetabolite production. With the development of recombinant DNA technology, geneticmanipulation of biosynthetic pathways has provided new tools for approaching yieldsimprovement of secondary metabolites. These methods are usually focused on redirecting25 precursor metabolic fluxes,deregulation of biosynthetic pathways and overexpression of specificenzymes involved in metabolic bottlenecks. In addition, the heterologous expression ofbiosynthetic gene clusters in other organisms, looking not only for an increase of production levelsbut also to speed the process.Keywords：Microbiology; Streptomyces; metabolic engineering; Precursor engineering;30 Regulation system; Heterologous expression
0 引言
随着对放线菌次级代谢产物了解的不断深入,其功能越来越多地被人们所了解,应用越来越广泛,人类对其需求量也越来越大。次级代谢物大多是分子结构比较复杂的化合物，根35 据其作用，可分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。微生物是许多药物，如抗肿瘤化合物、免疫抑制剂、抗病毒、抗寄生虫等药物的主要来源［1］。目前, 人类发现的大约23000 种具有生物活性的次级代谢物中，10000 多种化合物都是由放线菌产生的，其中80％的化合物是由链霉菌产生的［2］。商业药品不仅可以通过工业化的发酵法生产，也可以通过化学合成或半合成生产。当利用发酵法生产时，微生物菌株必须产生高效价的化合物，然而，40 从自然界中分离出的野生型菌株自身所拥有的生产能力往往达不到较好的应用效果，这就意味着必须对其进行遗传改造以此来满足工业化生产的要求。自从20 世纪40 年代青霉素发展以来，由微生物发酵所带来的大规模药品生产已经成为现代工业的基础，如今,青霉素产黄青霉的产量，已经从原来每株生产能力仅为60 mg/ L 提高到了70g / L。Demain 等［3］对脱氮假单胞杆菌进行操作，使维生素B12 的产量提高了100，000 多倍。目前，提高工业微生物生产率的方法有很多，其中一种是代谢工程，主要通过45 重组DNA技术引入的遗传修饰来改变主要代谢通量，从而提高主要次级代谢物的生产率。此外，现代技术的发展［4］，例如：DNA 序列分析、转录分析、基因组学、蛋白质组学、 代谢组学、转录组学和代谢分析学等技术的发展为改造微生物以提高天然产物的产量创造了新的机会。在这篇综述中，我们将主要讨论提高放线菌次级代谢物产量的遗传方法：（一）改变不50 同前体的代谢通量密度分布；（二）特殊生物合成途径的解除抑制；（三）增加一些抗生素的自我抵抗或者诱导抵抗 ；（四）超表达那些编码参与代谢产物生物合成酶的结构基因；
（五）利用全局基因遗传的方法，如基因组改组以及（六）在异源宿主以及工业优化菌株中
生物合成基因簇的表达。
1 利用前体工程增加代谢物产量
55 生物合成前体的利用是决定次级代谢产物生产率的一个关键因素。由多种含碳底物如脂肪酸、单糖或蛋白质等分解代谢而产生的前体都是由初级新陈代谢所提供，一些关键的酶可以通过主要碳代谢的代谢网络调节碳通量，通过对这些关键酶的鉴定和遗传操作，可以增加特定前体的利用率 。
1.1 糖代谢网络系统
60 在葡萄糖的分解代谢途径中，EMP 途径和戊糖三磷酸途径（PPP）相互关联地形成了代谢网络系统，专一途径中的关键酶调节着自身途径的碳通量。葡萄糖代谢途径的第一个中间体是葡萄糖六磷酸（G6P），它是磷酸葡糖异构酶（Pgi）、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（Zwf ）以及葡萄糖磷酸变位酶（Pgm）的共有底物。Zwf 将葡萄糖运送至戊糖三磷酸途径，Pgm 催化由G6P 转化为葡萄糖一磷酸（G1P）的可逆反应，致使碳流向以葡萄糖为基础的聚合物如65 糖原的生物合成方向或者6－脱氧已糖的生物合成方向［5］，但这并不是唯一的途径，该反应也可能使碳流向次级代谢的生物合成。Pgi 使得碳水化合物的分解代谢通过EMP 途径进入后续的三羧酸循环途径，该途径可以提供形成次级代谢物所必需的其他前体。EMP 途径以及戊糖三磷酸途径中的前几步进行遗传操作可以提高棒酸、放线紫红素和十一烷基灵菌红素的产量。棒酸链霉菌（Streptomyces clavuligerus）中，通过对糖酵解途径的70 遗传改造，将编码3－磷酸甘油醛脱氢酶的gap1 和 gap2 基因中断,使得该酶催化的D－甘油醛－3－磷酸转换为1,3－二磷酸甘油酸的反应不能进行。3－磷酸甘油醛和L－精氨酸又是棒酸生物合成的前体，在gap 突变株中，3－磷酸甘油醛的积累可以使抗生素产量显著增加，当精氨酸不断添加至培养物中时，棒酸产量可以提高3.1 倍［6］。黄秀梅发现［7］围绕产琥珀酸放线杆菌 NJ113 厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通75 量分析，发现添加PEP 后己糖磷酸途径 （HMP）与糖酵解途径（EMP）的通量比由 39.4∶60.3提高至 76.8∶22.6，解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾，导致 PEP 生成草酰乙酸的通量提高了23.8％，关键酶活分析结果表明，添加0.5 g/L PEP 后 PEP 羧化激酶比酶活达到 1910 U/mg，与对照相比提高了 74.7％，最终丁二酸浓度为 29.1 g/L，收率达到 76.2％，比未添加 PEP 时提高了 11.0％。80
1.2 脂肪酸前体的供应
有效地利用辅酶A 激活脂肪酸前体，可以提高许多多聚乙酰的产量，如红霉素、寡霉素、莫能菌素B、放线紫红素等。合成红霉素的两个前体分别是丙二酰CoA 和甲基丙二酰CoA，前者来源于乙酰CoA 的羧基化，而后者可以由不同的途径合成，主要有3 条合成途径：由丙酰CoA 在丙酰CoA 羧化酶的作用下生成;由丙酰CoA 和丙酮酸通过甲基丙二酰85 CoA 羧基转移酶（MCT）生成；由三羧酸循环的中间物琥珀酰CoA 通过甲基丙二酰CoA 异构酶（MCM）生成。红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）和红霉素气微菌（Aeromicrobiumerythreum）都是红霉素的产生菌，调节甲基丙二酰CoA 的代谢节点，可以提高抗生素产量。Reeves 等［8］在以葡萄糖为碳源培养基中培养红色糖多孢菌和红霉素气微菌，钝化它的甲基丙90 二酰CoA 异构酶基因mutB，可以使红霉素过量产生，而在以油为碳源的培养基中红霉素的产量减少。原因是以葡萄糖为碳源培养基，甲基丙二酰CoA 异构酶的作用是减少甲基丙二酰CoA 的量，通过将该酶钝化，使抗生素产量提高，而以油为碳源的培养基，甲基丙二酰CoA 异构酶的作用是增加甲基丙二酰CoA 的量。另外，在以油为碳源的发酵培养基中培养红色糖多孢菌，通过复制甲基丙二酰CoA 异构酶的操纵子mutA, mutB, meaB 和 mutR，也可以95 使红霉素过量生产。从这些实验中我们可以得出结论，在基本的生长条件下，碳源的流向主要由琥珀酰CoA 生成甲基丙二酰CoA 的过程决定。抗寄生虫药阿维菌素［9］和细胞生长抑制剂寡霉素是由阿维链霉菌（S. avermitilis）产生的大环内酯类抗生素，在阿维菌素的生物合成过程中，bkdF 的基因产物作为支链a 酮酸脱氢酶复合体的EIQ 亚基参与了阿维菌素起始单元的生物合成。bkdF 基因缺失会导致阿维链霉100 菌产阿维菌素能力的丧失，而通过启动附加的延伸单位进入寡霉素的生物合成途径，使大环内酯寡霉素过量生产。Ryu 等［10］发现产放线紫红素的天蓝色链霉菌（S.coelicolor）,通过修饰其前体，提高了聚酮化合物的产量.其中由于基因 accA2, accB 和accE 编码乙酰CoA 羧化酶的不同亚基，通过这些基因的超表达可以有效地促使碳源流向丙二酰CoA ，从而使得放线紫红素的产量提高六倍。105 1.3 辅因子的调节中央碳代谢的其他元素是代谢工程方法的靶元素，它像前体一样参与了次级代谢物的生物合成。例如S－腺蛋氨酸辅因子，在浅青紫链霉菌（S. lividans）和天蓝色链霉菌中［11］，S－腺苷－L－甲硫氨酸合成酶催化ATP 和甲硫氨酸合成S－腺蛋氨酸，编码S－腺苷－L－甲硫氨酸合成酶的壮观链霉菌（S. spectabilis）metK 基因超表达导致抗生素产量提高，在培养基中添加110 S－腺蛋氨酸也可以达到同样的效果，实验证明抗生素产量增加是由于诱导了途径特异性转录激活剂actII－orf4 表达的结果［12］。波赛链霉菌（S. peucetius）中，metK1－sp 和afsR－sp 基因的表达对苦霉素的产生过程也具有相似的作用，Maharjan 等［13］发现来自波赛链霉菌ATCC27952 的两个调节基因metK1－sp 和afsR－sp 在S. venezuelae ATCC 15439 中的过量表达诱导了专一途径的调节基因pikD 和酮合成酶（ketosynthase,KS）基因的表达，从而使得苦霉素115 的产量分别增加1.6 和2.6 倍。
2 操纵调控系统
次生代谢途径生物合成的基因通常都是以簇的形式存在于染色体上，包括途径特异性的调节基因。途径特异性的调节因子对于基因簇的表达即有正调控作用，又有负调控作用。一些基因簇包括不同数量的途径特异性正调控基因［14－15］。另外一些基因簇既包括激活剂也包括抑制剂。像泰洛星途径，包括两个激活剂，两个抑制剂编码基因［16］。然而120 ，在一些途径中没有调节基因，如红霉素［17］途径。此外，一些调节基因一般位于生物合成基因簇的外侧，在基因簇中起到调节的作用，对多种次级代谢物的生成起到多效性。最好的例子就是天蓝色链霉菌，它可以产生多种抗生素，途径特异性调节基因actII－orf4, cdaR, redD 和 mmyB 等起始了抗生素生物合成基因簇的转录，另外还有一些多效性调节基因afsR, absA1/A2 影响抗生125 素的产生以及细菌的形态发育［18］。因此，通过途径特异性正调节因子的超表达或者抑制剂的失活，解除次级代谢物的表达抑制是产量提高的最有效的方法。
2.1 途径特异性正调节
放线菌中大部分途径特异性激活剂都属于链霉菌抗生素调控蛋白家族（Streptomycesantibiotic regulatory proteins,SARP）。如actII－orf4、redD、vlmI 和dnrI 等基因编码的蛋白都130 属于此家族。SARP 正调节因子的超表达可以增加不同次级代谢物的产量。目前在链霉菌中发现了很多途径特异性基因参与次级代谢的调控,如天蓝色链霉菌中actII－orf4 调控放线紫红素生物合成,redD 调控十一烷基灵菌红素的生物合成，生绿链霉菌（Streptomycesviridifaciens）中，vlmI 是缬丙霉素（valanimycin）生物合成的激活因子［19］。波赛链霉菌可产生柔红霉素，它的生物合成基因簇中的dnrRI 和dnrRZ 两个基因对柔红霉素的生物合成具135 有调节功能。dnrRI 包括dnrl 和dnrJ 两基因，而dnrRZ 包括dnrO 和dnrN 两基因。Dnrl 属于SARP 家族，是柔红霉素生物合成的正转录调控因子。另外，LiuG 等［20］发现圈卷产色链霉菌（S.Ansochromogenes）中sanG 调控华光霉素的生物合成，多拷贝sanG 基因的插入使得华光霉素的产量增加。Hung 等［21］在小棒链霉菌中发现正调节基因ccaR 调控克拉维酸的生物合成，其中CcaR 蛋白对棒状链霉菌（S.clavuligerus）中克拉维酸的合成具有正调控作140 用,由ccaR 基因编码，增加ccaR 基因剂量可提高棒状链霉菌克拉维酸的产量［22］。泰乐菌素（tylosin）、柔红霉素、光辉霉素等次级代谢物的产生既能利用SARP 激活剂编码基因的正调节来实现，也可以利用途径特异性的正调节蛋白来实现［23］。Cundliffe E 等［24］在弗氏链霉菌（S.fradiae）中发现大环内酯类抗生素泰乐菌素的生物合成基因簇中至少存在五个途径特异性调控基因,分别是tylP、tylQ、tylS、tylT 和tylR。其中编码SARP 调节剂基因tylS 以及编145 码包含转座酶结构域蛋白的基因tylR 的超表达可以使得泰乐菌素的产量提高。在野生型菌株以及产泰乐菌素菌株内都发现泰乐菌素产量增加。编码SARP 调节剂DnrI 的基因dnrR1位点的超表达，以及编码正调节蛋白DnrN 和 DnrO 的基因dnrR2 位点的超表达，可以使紫红霉酮的产量提高10－100 倍，柔红霉素的产量提高25 倍［25］。其它没有SARP 激活剂的次级代谢物生物合成途径，可以利用途径特异性调节因子的正调节，如纳塔尔链霉菌（S.150 nataliensis），pimM 编码PAS/LuxR 调节剂，可使那他霉素产量提高［26］。SARP 家族蛋白通常只起到途径特异性调节的作用，但是，在某些情况下，也可起到控制多种次级代谢物产生以及形态分化的多效调节蛋白的作用。来自天蓝色链霉菌的 afsR 基因［27］通过在浅青紫链霉菌的过量表达可以提高放线紫红素和十一烷基灵菌红素的产量。在诺尔斯氏链霉菌（S. noursei ）和波赛链霉菌中，与AfsR 类似的SAPR 多效激活剂SsmA 和155 AfsR－p 分别增强了制霉菌素和多柔比星的生物合成［28］。
2.2 途径特异性负调节
途径特异性阻遏物或多效阻遏物的失活可以使次级代谢物产量提高。灰色链霉菌亚种，当途径特异性转录阻遏物cmmRII 失活时，色霉素可过量产生［29］。在泰乐菌素生物合成过程中，由于tylP 基因编码的r－丁内酯受体对抗生素的产生起到负调控作用，中断 tylP 基因可以提高次级代谢物产量并影响其形态分化。另外，TylQ 通过调控tylR 160 的表达抑制泰乐菌素的生成［30］，TylR 是泰乐菌素生物合成结构基因的总激活因子，因此转录阻遏物tylQ 的失活不能使抗生素的产量提高，但可以提前起始泰乐菌素的产生。在放线紫红素基因簇中存在一个编码LysR 型转录调节剂的基因actVB－orf10，在浅青紫链霉菌中通过该基因的失活也可使抗生素过量产生［31］。165 与次级代谢物磷酸盐调节有关的多效阻遏系统是一个双组分phoR–phoP 系统，在纳塔尔链霉菌中，phoR 的中断或者phoR 和phoP 的同时中断，都可以增加那他霉素的产量。而在浅青紫链霉菌中，删除相同的组分可以使放线紫红素和十一烷基灵菌红素产量分别提高5倍和12 倍［32］。Li W 等［33］在天蓝色链霉菌中发现了抗生素合成全局性负调节基因nsdA， nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达。170 3 引入抗生素抗性提高代谢物产量抗生素抗性筛选是基于微生物对抗生素产生耐药性发展起来的菌株选育改良技术,微生物的某些抗生素抗性突变会直接影响其次生产物的代谢调控系统,从而改变突变株代谢产物的生产水平和能力,因此抗性筛选可用于有用产物生产菌优良菌株的选育和改良。在微生物药物领域抗生素抗性筛选技术原本主要用来筛选获取高产菌株,但近来发现微生物的抗生素175 抗性突变还可赋予突变株新生次级产物的代谢生产能力。孙玉雯等［34］人认为抗生素生物合成基因簇通常包括一个或多个基因，这些基因编码不同的抵抗机制，使其克服产物毒性作用而达到自我保护。在某些情况下，这些抵抗系统不仅与其自我保护有关，也与抗生素的生物合成有关。因此，增加抗生素的耐药性可以用来筛选提高抗生素产量水平的突变型。
3.1 链霉素抗性筛选
180 基因分析显示,链霉素抗性突变株在核糖体S12 蛋白编码基因rpsL 上88 位发生了点突变,使S12 蛋白对应氨基酸由原来的赖氨酸突变为谷氨酸, Wang G 等［35］发现浅青紫链霉菌和天蓝色链霉菌中，核糖体蛋白质S12 对链霉素具有耐药性，编码该蛋白质的rpsL 基因发生突变，可以激活抗生素生产。对Streptomyces、Bacillus 和Pseudomonas 等3 个属野生菌株的链霉素抗性筛选研究结果表明,与野生株相比突变株的放线菌素等抗生素生产能力提高185 了5～50 倍,从突变株中筛选获得这些高产突变株的频率高达3％－46％,而且高浓度链霉素抗性株中正突变率较低浓度抗性株中高。天蓝色链霉菌A3（2）的巴龙霉素（paromomycin）抗性突变也可使放线紫红素的产量得到提高,基因分析显示高产突变株中编码核糖体S12 蛋白的rpsL 基因91 位发生点突变,由原来的脯氨酸突变为丝氨酸。在不同的链霉菌属中，通过突变型核糖体的介导，对一些抗生素产生耐药性，使得核糖190 体工程成为提高抗生素产量的一种合理方法。如产fredericamycin 的恰塔努加链霉菌（S.chattanoogensis）、产放线菌素的抗生素链霉菌（S. antibioticus）和产沙利霉素的白色链霉菌（S. albus）。Nishimura 等［36］在天蓝色链霉菌中，frr 基因编码核糖体重复利用因子，该因子在链霉素抗性rpsL 突变株内被发现，因此通过frr 基因超表达，放线紫红素产量提高近十倍。另外，rsmG 编码依赖于S－腺苷甲硫氨酸16S rRNA 甲基转移酶，在野生型天蓝色链霉195 菌中，rsmG 基因突变或者缺失，可以对链霉素产生弱的抵抗，增加放线紫红素的产量，并且其产量比rpsL 突变株高出1，000 倍。
3.2 多重抗生素抗性筛选
2 种以上抗生素进行组合,筛选获取对多种抗生素发生多重抗性突变的高产菌株,是提高
产能更为有效的抗性筛选方法。Hu 等［37－38］以产放线紫红素的天蓝色链霉菌为初始菌,经第1轮链霉素抗性筛选获得了产能比初始菌提高1.6－3 倍的突变株,再以高产突200 变菌株为出发菌,经第2 轮利福平或庆大霉素抗性筛选,得到了产能进一步提高1.7－2.5 倍的双重抗性突变高产菌株,最后以双重抗性菌株为出发菌株,经第3 轮庆大霉素或利福平抗性筛选,获得了与初始菌相比放线紫红素产能提高48 倍的链霉素、利福平和庆大霉素三重抗性高产突变株。这些抗性突变使核糖体产生异常蛋白和过度磷酸化鸟苷酸合成活性。当细胞进入稳定生长期时，鸟205 苷四磷酸启动了细菌次级代谢，从而表明鸟苷四磷酸和抗生素生物合成存在正相关的关系。另外，在所有这些突变株内，放线紫红素的过量生产与actII－orf4 基因高量表达有关，可能是因为增强了蛋白质合成［39］。
3.3 自产抗生素抗性筛选
在抗性筛选获取高产菌株的研究中,除上述抗生素之外还可通过筛选自产抗生素抗性来210 提高产量,如高产金霉素的金色链霉菌突变株［40］、高产土曲霉酸的黄柄曲霉突变株［41］等均通过自产抗生素抗性筛选获得。这种方法曾用于生产卡那霉素和新霉素这两种氨基糖苷类抗生素的生产菌，也曾用于引入能够编码氨基葡糖苷6,－N 乙酰基转移酶基因的生产菌中，该酶来自卡那霉素链霉菌（S. kanamyceticus），能提供氨基糖苷抗生素类耐药性，从而导致这些抗生素产量增加，尤其是新霉素的增加。在多种抗生素过量产生的有机体内也有同样的结果，215 如6－去甲金霉素链霉菌（S. aureofacien），通过与药物流出有关的自卫基因的超表达而实现产量增加，又如卡那霉素链霉菌，复制包括三个自我抵抗基因在内的整个卡那霉素基因簇，增强卡那霉素抗药性并且使抗生素大量生产［42］ 。
4 生物合成的结构基因操纵
4.1 基因剂量增加
220 白小佳等［43］发现由ccaR 基因编码的ccaR 蛋白对棒状链霉菌中克拉维酸的合成具有正调控作用。在S.clavuligerusB71－14 基因组中增加一个拷贝ccaR 基因,所得突变株S.clavuligerusB71－14：ccaR 产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54 倍。球孢链霉菌C－1027（S.globisporus C－1027） 可以产生一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素（lidamycin）又名C－1027,。SgcR3 是C－1027 生物合成的正调控因子，增加SgcR3 基因的拷贝225 球孢链霉菌中C－1027 的产量提高30％－40％［44］。控制葡萄糖的分解代谢，或者改变与特殊代谢产物生物合成有关的结构基因的表达，都能使葡萄糖中的碳流向易于产生次级代谢物的方向。其中6DOH 途径中的基因就可以进行这种操作。编码二磷酸核苷葡萄糖合酶的sgcA1 基因与6DOH 4 －脱氧 4－（二甲氨基）－5,5 －二甲基－D－吡喃核糖的生物合成有关，球孢链霉菌中sgcA1 基因被用于C－1027 的生产。sgcA1230 基因的单独超表达使得C－1027 产量提高两倍，如果编码 C－1027 载体蛋白的cagA 基因也一同表达，可使产量提高4 倍。编码与6DOH 生物合成有关酶类的基因，如sgcA1 基因，通常是和与配基合成有关的其他次级代谢物生物合成基因簇聚集在一起［45］。在生物合成基因簇外面也发现与6DOH 生物合成有关的基因［46］，它们共享初级与次级代谢。与L－鼠李糖生物合成有关的基因也在基因簇外面［47］，刺糖多孢菌（Sac. Spinosa）L－鼠李糖生物合成基因中，复制编码二磷酸核苷葡萄糖合酶的gtt 235 基因和编码二磷酸核苷葡萄糖脱水酶的gdh 基因，可以提高多杀菌素产量。其中这两种酶主要负责G1P 流向产生L－鼠李糖和L－二甲基氨基糖的生物合成途径［48］。其他初级代谢前体，如G3P、赖氨酸、酮戊二酸，可以通过利用具体生物合成途径的结构基因来加强一些次级代谢物的合成。Goo KS 等［49］在小棒链霉菌中，棒烷酸合酶基因cas2240 的超表达或者将其整合到染色体上，克拉维酸的产量可提高5 倍。若将专一途径激活剂ccaR和棒烷酸合酶基因cas2 同时整合到染色体上，产量可提高23 倍。另外复制编码前克拉维酸脒基水化酶的pah2 基因也可使棒酸产量提高［50］。
4.2 基因失活或敲除
提高代谢产物产量的另外一种方法是基因敲除［51］，敲除那些可以编码将代谢物转换为245 另一种不同物质的基因。如波赛链霉菌中，wblA 基因是全局性负调控基因，将该基因敲除可以使柔红霉素的产量增加70％, dnrX 和dnrH 基因，与柔红霉素和多柔比星转化为多糖基化形式的巴龙霉素有关，dnrX 和dnrH 失活，使多柔比星的生物合成提高3 倍，柔红霉素提高8.5 倍［52］。另外,dnrU 与柔红霉素转化为1,3－二氢柔红霉素有关，将dnrU 中断可使多柔比星的生物合成得到同样增加。多柔比星的产量可以通过同一菌株中多个基因中断进一步提250 高。在dnrU/dnrX 双重突变株中，产量可提高7 倍，在dnrU/dnrX/dnrH 三重突变株内，产量可提高26 倍。在双重或三重突变株内，与多柔比星生物合成最后一步有关的基因dnrV 和doxA 的超表达可使产量提高1.3－2.8 倍［53］。Liras P 等［54］在小棒链霉菌中，通过与前体供应有关的氨基酸修饰使碳流向利于棒酸产生的方向，该菌株同时也生产头孢霉素C 和其他棒烷，编码赖氨酸氨基转移酶的潜在基因255 失活能提高头孢霉素C 的产量，这一失活同样使棒酸产量增加［55］。产生同样作用的还有，cvm1 的失活，使非棒酸的棒烷产量降低。潜在基因失活和cvm1 的失活这两种方法适用于同样的生物体。小棒链霉菌的一株工业菌株，其棒酸产量得到很大提高，比野生型菌株高出几个数量级［56］。生物合成的基因缺失有时也会提高次级代谢物的产量。如诺尔斯氏链霉菌中，nysF 编260 码4－磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，该酶被认为与制霉菌素I 型多聚乙酰合酶上酰基载体蛋白的翻译后修饰有关,对制霉菌素的产生起到负调控的作用，nysF 的失活增加了制霉菌素的产量［57］。在南昌链霉菌产南昌霉素的例子中，包含多聚乙酰合酶在内的基因簇选择性缺失，可以提高产物产量，这种缺失可能影响其余多聚乙酰合酶的前体供应，在南昌链霉菌中发现八个这样的基因簇，并且它们中的任何一个失活都会使南昌霉素的产量提高三倍［58］。265 4.3 基因修饰的应用多拉菌素（又名CHC－B1）是一种抗蠕虫药的多聚乙酰复合物，由阿维链霉菌突变株产生。该菌株缺少由bkdF 编码的支链a－酮酸脱氢酶的活性,可产生两种相关化合物，CHC－B1和CHC－B2。CHC－B2 转化为多拉菌素的过程还未弄清，可能与一种未知功能的aveC 基因有关。通过插入失活、定点突变和错配PCR 等技术对aveC 基因进行修饰，获得CHC－B1270 与CHC－B2 的比例增大4 倍的突变株。经过上述改造获得的工程菌，其多拉菌素的产量大大提高，并应用于工业生产。进一步促进多拉菌素生产，还可以通过aveC 半合成的DNA 重组和最适的染色体插入来完成［59］。
4.4 外源基因的表达
弗氏链霉菌是泰乐菌素的产生菌，它严格好氧，其发酵液由于较粘稠而导致溶氧较差，因此溶氧成为泰乐菌素产量提高的限制性因素之一。陈文青［60］通过在弗氏275 链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因（vhb）来改善氧的传递，VHb 蛋白的表达可促进泰乐菌素的合成与菌体的生长，提高泰乐菌素的产量。李佳玮［61］用同样的方法，在阿维链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因也可改善菌体生长，提高阿维菌素的产量。螺旋霉素链霉菌F21，将来自生米卡链霉菌（S.mycarofaciens ）1748 酰基转移酶基因ist 的拷贝插入到染色体上，生技霉素的280 产量增加［62］。红霉素抗性基因ermE 编码一种甲基化酶,可以对50S 核糖体亚基上的23S rRNA进行甲基化修饰．将来自红色糖多孢菌的ermE 基因克隆到链霉菌高拷贝表达载体，构建出了链霉菌表达质粒pKIM4,pKIM7 和pKIM8。通过提高ermE 表达量的方法，来提高生产菌自身的耐受性，最终使得红霉素产量升高［63］。
5 全基因组改组
285 全基因组改组已经被认为是一种迅速提高次级代谢物产量的新方法。弗氏链霉菌通过传统的方法进行两轮的基因组改组，可以使泰乐菌素的产量提高6 至8 倍，而通过传统的方法获得同样效价则要经过20 轮的诱变和筛选。链霉菌sspp.U121 通过一次利用亚硝基胍诱变后再进行三轮基因组改组后已大量生产（ 2S ,3R）－羟基柠檬酸［####－65］。梁惠仪等［66］从豆豉里面筛选得到1 株具有纤溶酶活性的枯草芽孢杆菌DC－12，进行2 轮基因组改组。从第1290 轮改组菌株中获得6 株正突变株，与原始菌株DC－12 一起作为亲本，进行第2 轮改组，筛选获得5 株酶活在1600U/mL 以上（最高酶活2600U/mL）的正突变株，较亲本菌株提高了4～5 倍。表明在基因组改组过程中，结合原始菌株进行下一轮改组能获得很好的效果。朱惠等［67］在改组纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌（S.gilvosporeus）SG－1 的过程中，对常规的改组技术操作路线作了改进。将第1 轮改组再生菌落（包括融合体和亲本）不经过筛选，而直接295 用于制备原生质体后进行下一轮改组。最终仍筛选得到14 株高产改组菌株，其中1 株S.gilvosporeus GS－74 的纳他霉素产量为3574mg/L，是产量最高的亲本菌株的1.5 倍，比原始出发菌株SG－1 提高1.17 倍。
6 整个基因簇的异源表达
DNA 操纵工具的快速发展和基因测序技术的改善使得分离参与天然合成产物的基因簇300 不再是难题。然而，在某些情况下编码化合物的效价很低，在个别生产菌中并没有遗传工具来优化代谢工程。针对这些问题可以提出一些解决方案，例如，可以将次级代谢途径转移到新的宿主体内，在这些宿主体内可以利用遗传工具，从而进行异源性生物活性化合物的表达
［68－69］。
6.1 异源表达质粒的应用
305 在天蓝色链霉菌中，可以利用特异性质粒来提高异源次级代谢物的产量。将来源于质粒SCP2＊的pJRJ2 和SCP2＠整合得到质粒pSMALL，利用pSMALL 生产15 －甲基－6－脱氧红霉内酯（6－dEB），可以使其在天蓝色链霉菌和浅青紫链霉菌中的产量提高四倍，原因可能是由于基因数量的增加和较高的质粒稳定性。如果质粒pBOOST 替代SCP2＠整合，6－dEB 产量可以进一步提高至25 倍［70］。将柔红霉素的产生菌波塞链霉菌ATCC 27952 中dnrN, dnrI,310 afsR 和metK1－sp 基因克隆到pIBR25 表达载体上，将构建的表达质粒pNI25 （dnrN－dnrI ）,pNIS25 （dnrN－dnrI－metK1－sp）和pNIR25 （ dnrN－dnrI－afsR）转到波塞链霉菌中表达, 重组菌株的柔红霉素产量分别提高1.2、1.4 和4.3 倍［71］。
6.2 利用链霉菌作为宿主体
异源表达可以作为遗传工具对特定基因簇进行鉴定，从而提高代谢产物的产量。如在百金花属酵母中巨霉素的生产。巨霉素最初是在黑孢小单孢菌（M. megalomicea）315 ）中产生，它在结构上与红霉素非常相似。在M. megalomicea 中巨霉素产量非常低，于是尝试在百金花属酵母中表达，结果巨霉素产量显著增加。Park SR 等人［72］将同样的方法用于泰乐菌素糖苷配基泰乐酮的生产，在委内瑞拉链霉菌菌株中通过泰乐菌素多聚乙酰合酶基因的表达而实现，前提是委内瑞拉链霉菌中苦霉素多聚乙酰合酶基因要预先删除以防止酰基CoA 前体的320 竞争。此外，通过引入苦霉素专一途径正调节基因pikD 的拷贝，可以使产物产量提高17.1倍［73］。不同次级代谢基因簇在异源宿主菌中的表达通常还与前面描述的一些提高代谢产物产量的方法有关，如脂肪酸前体供应、与6DOH 代谢有关的基因超表达、专一途径的调控基因等。对于产3－氨基香豆素新生霉素的类球形链霉菌（S. spheroides），Ou X 等［74］将整个基325 因簇在天蓝色链霉菌M512 中独立表达，产生与原始菌株等量效价的复合物。天蓝色链霉菌中，将调控基因novG 引入到多拷贝的质粒中，可使新生霉素产量提高三倍。引入与L－鼠李糖生物合成有关的基因， novclobiocin 122 的产量提高8－26 倍［75］。在异源宿主体内，为增强次级代谢物的产生，如何操纵脂肪酸前体供应成为一个关键因素，在天蓝色链霉菌中可生产6－dEB。6－dEB 由丙酰CoA 和甲基丙二酰CoA 生产，通过基因330 matB 和matC 的异源表达，该产物效价可以提高三倍［76］，基因matC 来自三叶草根瘤菌，与丙二酰CoA 和甲基丙二酸CoA 的产生有关，其中丙二酰CoA 和甲基丙二酸CoA 来自外源丙二酸盐和甲基丙二酸。Chng C 等［77］在天蓝色链霉菌中，表达来自红色糖多孢菌的红霉素多聚乙酰合酶，可使6－dEB 产量提高。
6.3 利用其他微生物作为宿主体
335 次级代谢物的产生不仅对最终产率非常重要，对发酵过程也很关键。为了达到化合物过量生产的目的，在大肠杆菌中，基因簇的外源表达不仅可以减少发酵时间，而且可以实现工业化规模的发酵。红霉素多聚乙酰合酶的表达是通过来自天蓝色链霉菌的 PCC 基因表达促进甲基丙二酰CoA 的产生，通过大肠杆菌生物素连接酶基因birA 的超表达增强了生物素标记亚基PccA 的活性，结果产生同红色糖多孢菌工业株等量的6－dEB，若将来自壮观链霉菌340 编码SAM 合成酶基因metK 进行表达，还可使6－dEB 的产量提高两倍［78］。大肠杆菌中，一些来自megosamine 途径的附加基因，编码与6DOH 生物合成及其他修饰有关的酶，通过红霉素多聚乙酰合酶和17 个附加基因的表达可以生产红霉素C 和D［79］。其他异源宿主菌，如酿酒酵母菌，利用类似的方法可以生产多聚乙酰。除此之外，其他的次级代谢物，如非核糖体的肽类，可以在大肠杆菌中表达,但前提是菌株必须要导入NRPS345 进行翻译后修饰所需的sfp 基因。同样，将从拉沙里链霉菌（S.lasaliensis）分离到的整个基因簇在大肠杆菌中进行表达，可以生产抗癌抗菌素棘霉素和它的中间体丙霉素A［80,81 ,82］。
7 结论
制药业未来的成功关键在于发现新化合物并对其进行结构鉴定。目前，许多次级代谢产物生物合成基因簇已得到克隆, 基因结构与功能也已得到阐明,并且成功构建了一系列大容量载体和合适的宿主表达系统，这就为利用组合生物学合成新化合物提供350 了新的遗传工具。利用不同的遗传和代谢工程方法，如基因缺失和基因超表达，在野生型生物体和异源表达的宿主体内，生物合成基因簇的表达使次级代谢物产量得到显著提高。通过改变新陈代谢关键部分的主要代谢网络途径，调节碳通量也可以达到提高代谢产物产量的目的。除此之外，通过将克隆的生物合成基因簇在宿主体内进行异源表达，还可以快速、大量的获取目标产物。355
［参考文献］ （References）
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