通过PCR从鲁西黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了 a干扰素（BoIFN-a)基因，并插入到pET32a +中，构建成重 组原核表达质粒PET32a+/BoIFN-a,进行测序和诱导表达。测序结果表明，鲁西黄牛IFN-a基因全长498个核苷酸,含一个开 放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛a干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经 SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲 和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5 x 105u/mg。重组牛IFN-a( rBoIFN-a)对牛轮状病毒(BRV)有一定 的抑制作用，抗BRV病毒活性为1.5xl(fu/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了 IFN-a基因的一种新亚型，即BoIFN-aC2,并实 现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物，为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
干扰素（interferon，IFN)是一类具有高活性，多功能的蛋白，具有广谱抗病毒，抗肿瘤及免疫调节功能[1]。牛干扰素分为I型和"型，其中I型干扰素 又分为a、、W、亚型，均为无内含子的单拷贝或多 拷贝基因，并具有广谱抗病毒作用[,]。以人IFN-« 基因为探针从牛的cDNA文库中克隆了牛IFN-a基 因（BoIFN-a)，推测BoIFN-#至少有10 ~ 12个亚型， 并测序了其中A、B、C、D亚型[3，]。Chaplin[5]等 (1996)从病毒感染的肠上皮细胞中克隆了 BoIFN-a E亚型，并进行了重组表达研究，Paul[6]等（1996)克 隆了 G、F、H亚型，史喜菊等[7](2003)重组表达了 I、 J亚型。
近年来，由于病毒感染引发的奶牛传染性疾病 发病率明显增加，给我国奶牛养殖业造成了较大危 害。而相关重组牛干扰素在抗水泡性口炎病毒，口 蹄疫病毒，牛病毒性腹泻病毒，呼吸道合胞体病毒研 究中均有较好效果[8_11]。为获得具有自主知识产权 的牛重组干扰素类制品，本文克隆了鲁西黄牛IFN-« 基因，重组到PET32a( + )表达载体中，构建成重组 原核表达质粒pET32a( + )/BoIFN-a,并在大肠杆菌 中进行高效表达研究，纯化了表达产物并进行了抗 病毒活性分析。
1材料和方法
1.1试验材料
1.1.1载体、细胞、病毒：PMD18-T载体购自 TaKaRa 公司；PET32a ( + )载体与 BL21 ( DE3 )购自 Novagen公司；水泡性口炎病毒（VSV )、牛轮状病毒 (BRV)、牛胎肾细胞(MDBK)购自中国兽医药品检定 所;重组人a干扰素购自山东金泰生物工程有限公 司。
1.1.2工具酶、试剂：各种工具酶购自TaKaRa公 司；DMEM培养基为GIBC0产品；回收试剂盒购自 u-gene公司；Ni-NTA纯化柱购自QIAGEN公司。
1.2方法
1.2.1引物：根据BoIFN-a基因序列（Accession number M10954 )以及酶切位点分析，在其开放阅读 框(0RF)两侧设计一对引物，由Sangon公司合成。 上游引物：5X-CCGGATCCTGCCACCTGC CTCACACC- 3'，包含一个BamH I酶切位点；下游引物：5X- TCAAGCTTGTCCTTTCTCCTGAAACTCTC-3 '，包含一个 Hin d'酶切位点。
1.2.2BoIFN-a基因重组克隆质粒的构建:按常规 方法提取鲁西黄牛血液基因组DNA，进行PCR扩
增。PCR扩增体系总体积为20yL,含上下游引物各 0.5^L。反应条件 95°C 10min, 94[ 30s，69°C 30s， 72[ 1min，30 个循环，72C 10min。PCR 产物经
0.8%琼脂糖凝胶电泳回收，连接pMD18-T，构建重 组质粒pMD18-T/BoIFN-a，将重组质粒转入大肠杆菌 JM109，经氨苄青霉素（AMP)抗性、半乳糖苷酶蓝白 斑筛选，Bam HI、Hin d '双酶切鉴定以及PCR鉴 定。
1.2.3BoIFN-a序列分析：将鉴定正确的重组质粒 送Sangon公司测序，采用BLAST进行同源性比较。
1.2.4BoIFN-a基因重组表达质粒的构建：BamH
1、Hind'双酶切pMD18-T/BoIFN-a，回收目的片 段，pET32a( + )进行同样酶切，T4 DNA连接酶连接， 构建重组表达质粒pET32a( + )/BoIFN-a。将重组质 粒进行BamH I、/fcdll双酶切鉴定以及PCR鉴定。
1.2.5BoIFN-a基因表达条件优化、SDS-PAGE分 析：将重组质粒 PET32a( + )/BoIFN-a 和 PET32a( + ) 载体分别转化BL2KDE3)感受态细胞，经氦苄青霉 素抗性筛选挑取单个阳性菌落，接种于3mL LB液体 培养基[9]，37°C振荡培养，当达到0.6时加入 IPTG至终浓度lmmol/L，30°C培养4h，收集菌体，煮 沸裂解变性用于15%SDS-PAGE[U]，鉴定表达产物， 同时设不加IPTG诱导的对照组。
1.2.6纯化与复性：以QIAGEN公司提供的试剂盒 按提供的操作步骤纯化重组蛋白。详细过程如下： 取10mL菌体尚心，沉淀重悬于lmL buffer B (8mol/L urea，O.lmol/L NaH2P04> O.Olmol/L Tris-Cl，pH8.0)， 室温下振摇1h，离心收集上清;600juL上清加入预先 平衡的Ni-NTA柱中，700)离心2min，收集流出液； 用 600juL buffer C ( 8mol/L urea，0. 1mol/L NaH2 PO4， 0.01mol/L Tris-Cl，pH6.3)洗涤，700g 离心 2min,收 集流出液;洗脱蛋白用200juL buffer E (8mol/L urea， 0.1mol/L NaH2P04，0.01mol/L Tris-Cl，pH4.5)700g 离心2min，收集的洗脱液即为纯化蛋白，采用15% SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。采用逐步降低尿素 浓度的稀释复性法进行复性。目的蛋白用Bradford 法(1976)进行定量[14]，以BSA作标准，测定样品的 OD595 值。
1.2.7抗病毒活性分析：采用细胞病变抑制法。 细胞培养板常规培养MDBK至单层后，各孔中分别 加入人a干扰素1 ] 10倍倍比稀释液和rBoIFN-a 1 ]2 倍倍比稀释液100yL,过夜培养后分别加入100 挪画自兔函姑痛廳_腳察病..寒0 r巍对
全病变后，结晶紫显色，酶标仪测OD550值。并以人 IFN核准成国际单位。
1.2.8抗牛轮状病毒结果：96孔细胞培养板常规 培养MDBK至单层后，每孔加入100! 2倍倍比稀 释的rBoIFN"过夜培养后用100 TCID50 BRV攻毒，
48 h后观察细胞病变抑制结果，同时设细胞和病毒 对照。
2结果
2.1牛IFN-a基因的克隆
以牛血液DNA为模板，PCR扩增特异性片段， PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后，在500bp处有一 条特异的DNA条带（图1)，与报道的BoIFN"大小 相符。回收该片段，重组到pMD18-T载体中，酶切、
测序鉴定。
2.2序列分析
鲁西黄牛IFN"基因测序结果以及推导的氨基 酸序列如图2所示，克隆的基因0RF为498bp (Accession number DQ396807)，编码 166 个氨基酸的 成熟多肽，无糖基结合位点，与已报道的BoIFN" C 亚型核苷酸序列的同源性为98.6;，有7个碱基发 生了变异，氨基酸序列同源性为97.6%。
2.3重组表达质粒的构建与鉴定
将所克隆的BoIFN"重组入pET32a( + )，构建 原核表达质粒 pET32a( + )/BoIFN-a，经 BamH I、 Hind$双酶切后可见在500bp处有一条特异的DNA
条带，而且PCR扩增出500bp特异条带（图3)，说明 重组质粒构建正确。
2.4SDS-PAGE及纯化结果
SDS-PAGE分析表明在30]、4h时表达量最高 而不同IPTG浓度对其表达影响不大；SDS-PAGE及
纯化结果如图4所示，IPTG诱导株与纯化产物都在40ku左右表达出了 1条特异蛋白带，与预测分子量 一致。经BandScan5.0分析，蛋白产量约占菌体总 蛋白的26.7%。经蛋白可溶性分析，所表达蛋白以 包涵体形式存在，包涵体占沉淀蛋白的30.9%。
2.5抗病毒活性
纯化的重组牛干扰素能有效地抑制VSV对 MDBK细胞的致病作用，表现出较高的抗VSV病毒 活性，其活性为5 X 105u/mg。
2.6抗牛轮状病毒效果
rBoIFN-a处理MDBK后，BRV进行感染，48h后 空白对照组细胞正常，病毒组发生了明显的病变，而 加入1:2U稀释度的rBoIFN!样品组，细胞仍未出现 明显病变。经换算rBoIFN!抗BRV病毒活性为1.5 X 105u/mg。
3讨论
本研究从鲁西黄牛血液中扩增出了！干扰素基 因，测序结果显示该基因与已报道的BoIFN-«基因 长度完全一致，由498bp编码166个成熟多肽，含一 个ORF[3’4]。与已报道的BoIFN! C亚型相比4个氨 基酸发生了点变异，第75位Met— Thr，第86位Asp !Ala，第 97 位 Phe—Ala，第 135 位 Arg—Lys，同源性 为97.6% ’与其他几个亚型氨基酸序列同源性在 91.0% ~ 95.2%之间，与我国史喜菊等人克隆的荷 斯坦奶牛、晋南黄牛、福安水牛、富钟水牛的IFN-! 氨基酸同源性分别为92.8%、93.9%、97.2%、 96.2%[15，6]。根据国际干扰素命名委员会建议，在 一特定的干扰素型别内，有氨基酸序列或组成方面 的差异时可确定为亚型，鲁西黄牛IFN-!基因是一 种新亚型，建议命名为BoIFN-a C2，在GenBank中登 录号为DQ396807。
经软件分析，所得基因序列内部无BamH I、 Hind #酶切位点，pET32a( + )/BoIFN-a经上述两种 酶切后，不影响基因序列编码区的内部结构。原核 表达载体pET32a( + )，含T7启动子和转录终止信 号，其特点除了能够编码6个组氦酸残基外，还带有 大肠杆菌TrxA基因,TrxA基因编码109个氦基酸的 硫氧还蛋白，外源基因经多克隆位点插入后与Trx A 一起融合表达，不仅提高了表达产物的稳定性，而且 由于表达蛋白N末端含6个组氦酸，易于用亲和层 析柱纯化、鉴定。重组蛋白经尿素变性、梯度浓度尿 素和PBS分步透析复性后，在MDBK/VSV系统上测 得的活性为5 x 105u/mg,抗BRV病毒活性为1.5 x 105 u/mg,说明纯化过程不影响重组蛋白的生物学活 性，利于规模化生产。由此也表明黄牛IFN-«基因 序列的变化并没有引起抗病毒活性的改变。
在构建表达载体时，考虑到真核生物的信号肽 在原核生物中进行表达时大部分不具有分泌功能， 干扰素的信号肽蛋白可能会影响到重组干扰素的生 物学活性，本研究只克隆、表达了牛！干扰素成熟蛋 白基因，避免了信号肽对成熟蛋白的生物活性的影 响。
干扰素有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高 免疫功能等作用。由于病毒病一直困扰着我国的养 牛业，造成巨大的经济损失，因此奶牛业生产中需要 干扰素类广谱抗病毒生物制剂来治疗和加强疫苗的 免疫效果。本研究率先在我国克隆了鲁西黄牛干扰 素基因，在大肠杆菌中成功表达了牛重组干扰素蛋 白，并对其抗病毒活性进行了分析，为重组牛干扰素 的临床应用打下了基础。
