豆粕以其良好的营养特性被誉为植物性蛋白质饲料“之王”，成为蛋白质资源的首选。然而由于豆粕中含有多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、植物凝集素、低聚糖和抗原蛋白等限制其使用[1]。近几年来，国内大豆生产量下滑，加之畜牧业的发展使对豆粕的需求旺盛，其需求大和资源紧缺的矛盾日益突出，给饲料工业带来了严峻的挑战。当前，提高豆粕的营养价值和利用效率一直是理论研究和实际生产需求的热点课题。而利用益生菌进行发酵处理是一条经济有效的途径[2]。
益生菌发酵可将豆粕中大分子蛋白质降解为多肽、小肽及游离氨基酸[3, 4, 5]，除去多种抗营养因子，平衡豆粕氨基酸，提高其消化利用率。经发酵处理的豆粕还富含益生菌体、有机酸和多功能小肽等活性物质，能缓解仔猪断奶应激、降低仔猪腹泻率、改善畜禽胴体品质[6, 7]、提高动物生产性能和免疫能力[8, 9, 10]。
当前，关于不同发酵方式改善豆粕品质的研究已屡见不鲜，但绝大部分试验参数是基于实验室小试条件下高料水比发酵的结果，与实际大规模生产需求存在一定差距。另外，传统豆粕的处理一般采用微生物发酵或者添加外源蛋白酶酶解2种途径，而将微生物与蛋白酶联合处理豆粕的研究鲜有报道[11]。为此，本试验模拟实际生产中发酵料层高度，原料粉碎粒度采用工厂生产标准并且不经灭菌处理，发酵用水量设计在更具经济价值的低水分区段，通过筛选出最优复合益生菌发酵豆粕工艺参数并进一步研究蛋白酶对其发酵品质的影响，以期为实际生产中豆粕资源的高效、低成本利用提供理论依据。
豆粕，粗蛋白质含量为43.36%(实测)，粉碎过3.0筛板；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)，酵母活菌数≥2.0×1010 个/g，购自安琪酵母股份有限公司；米曲霉(Aspergillus oryzae)，有效孢子含量≥2.0×109 个/g，购自百惠生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，有效孢子含量≥2.0×1010 个/g，购自安琪酵母股份有限公司；发酵用蛋白酶，有效成分为中性蛋白酶，活性为30 000 IU/g，购自湖南利尔康生物有限公司。
第1步：主要采用对比试验，涉及发酵豆粕4个料水比水平(1∶ 0.3、1∶ 0.4、1∶ 0.5、1∶ 0.6，风干基础)在不同发酵时间段(0、24、48、72 h)的变化，每个组3个重复，各个时间点连续采样，在此基础上通过测定不同时间点的发酵效果来选择最优发酵参数。第2步：在该推荐发酵参数的基础上设计加酶试验组和无酶对照组，通过测定粗蛋白质、真蛋白质、干物质、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和游离氨基酸含量，以研究添加蛋白酶对豆粕发酵品质的影响。
将96%豆粕、2%麦麸和2%玉米粉混合均匀。根据本课题组前期所做的不同微生物发酵豆粕的添加量及配比参数，按原料重的0.5%计算菌粉总添加量，再根据酿酒酵母∶ 米曲霉∶ 枯草芽孢杆菌=5∶ 1∶ 2的比例计算各菌粉接种量。发酵用水按不同料水比计算添加。底物混合均匀后装入发酵桶(每桶装量约30 kg)于室温(28~29 ℃)下发酵。
按上述方法混合不同料水比发酵底物(不添加蛋白酶)，每个料水比做3个重复，发酵至72 h，期间在0、24、48、72 h开盖，测定物料中心温度，并每次移取约200 g样品，取3.00 g鲜样测定pH，剩余鲜样65 ℃烘干，粉碎过40目筛，阴凉干燥处保存待测其他指标。
在推荐发酵参数下，按照上述方法混合发酵底物，对照组不加酶，试验组加酶，根据蛋白酶使用说明推荐剂量，试验组蛋白酶添加量为发酵底物的0.01%，试验组每组设3个重复。发酵终止时取样约200 g于65 ℃烘干，粉碎过40目筛，阴凉干燥处保存待测指标。
用温度计测定发酵物料中心温度，取样用浸提法[12]结合pH计测定鲜样pH,初水分、粗蛋白质、粗灰分、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量参照张丽英[13]的方法进行测定，游离氨基酸含量参照朱燕等[14]采用的茚三酮显色法进行测定，挥发性盐基氮(TVBN)含量参照朱燕等[14]采用的半微量蒸馏法测定，真蛋白质参照胡永娜等[15]采用的三氯乙酸沉淀法测定。蛋白质分子质量参考Sadeghi等[16]的方法，采用不连续SDS-PAGE对发酵豆粕进行蛋白质电泳。
试验结果使用Excel 2007进行预处理，用SPSS 19.0统计软件对结果进行双因素方差分析，采用Duncan氏法多重比较检验，结果以平均值±标准差表示(显著水平为P<0.05),SDS-PAGE电泳图谱使用Banscan(version 5.0)软件分析。
由表1可知，发酵温度呈先上升后下降的趋势，各料水比在发酵24 h时均达到最高温度，48 h发酵温度略高于室温(28~29 ℃)，而72 h发酵温度几乎同于室温，说明微生物在48 h后发酵作用微弱。其中料水比为1∶ 0.4时的发酵温度在各时间点均为最高值，一定程度上说明其微生物最活跃且持续时间长。
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表1 发酵时间和料水比对豆粕发酵指标和营养指标的影响(风干基础)
Table 1 Effects of incubation time and ratio of material to water on fermentation indexes and nutrition indexes of fermented soybean meal (air-dry basis)
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发酵过程中pH缓慢下降，料水比为1∶ 0.4时各时间点的pH总计值显著低于其他料水比(P<0.05)，各料水比发酵72 h时的pH总计值显著低于其他时间点(P<0.05)。在pH上，发酵时间与料水比交互作用显著(P<0.05)。
发酵过程中粗蛋白质含量呈先上升后下降趋势。0 h粗蛋白质含量在41%左右，48 h各料水比组粗蛋白质含量达到最高，相对于0 h分别提高了4.39、5.67、3.90和6.22个百分点，所有组中，以料水比为1∶ 0.6时发酵48 h的粗蛋白质含量最高，达到47.29%，48 h后略有下降。
发酵过程中真蛋白质含量整体呈先上升后下降趋势，48 h各料水比组真蛋白质含量均上升到最高，之后略有下降。在真蛋白质含量上，发酵时间和料水比两因素交互作用显著(P<0.05)，其中料水比1∶ 0.4在发酵48 h条件下真蛋白质含量上升最高，达到43.34%。
发酵过程中初水分含量呈缓慢升高趋势，0～24 h初水分含量上升明显，之后变化幅度减小。1∶ 0.6料水比初水分含量显著高于其他水平组(P<0.05)。
发酵过程中挥发性盐基氮含量总体呈先升高后缓慢下降的趋势，且随着料水比的增加呈相应的梯度增加，其中1∶ 0.6料水比在发酵48 h时挥发性盐基氮含量最高，达到38.10×10-2 mg/g。
综上所述，随着料水比的递增，发酵豆粕的温度、pH和真蛋白质含量都呈梯度变化，其中料水比1∶ 0.4组部分发酵指标优于其他组。而粗蛋白质含量指标显示料水比1∶ 0.6组最优，但其发酵后挥发性盐基氮含量过高，影响发酵豆粕商品质量。另外，1∶ 0.6料水比发酵后水分含量过高，极大增加了生产成本。综合考虑后本试验选取1∶ 0.4为推荐生产料水比。就发酵时间而言，初水分、粗蛋白质和真蛋白质含量在发酵48 h达到最高，其后又显著下降。温度和pH在发酵48~72 h变化幅度减小，说明发酵48 h时微生物作用已很微弱。因此本试验选取48 h作为推荐发酵时间。
由表2可知，与对照组相比，试验组粗蛋白质含量无显著变化(P>0.05)，而真蛋白质含量显著降低(P<0.05)，游离氨基酸含量提高了0.36个百分点(P<0.05)，干物质含量降低了4.11个百分点(P<0.05)，粗灰分、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维都略有降低，但差异不显著(P>0.05)。
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表2 添加蛋白酶对豆粕发酵常规营养成分的影响(风干基础)
Table 2 Effects of protease supplementation on routine nutrient composition of fermented soybean meal (air-dry basis) %
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SDS-PAGE电泳检测蛋白质分子质量的结果见图1。
SDS-PAGE电泳图谱使用凝胶电泳图谱分析软件Banscan(version 5.0)扫描每个条带的光密度，并设定40 ku以下为小分子蛋白质，40～60 ku为中分子蛋白质，60 ku以上为大分子蛋白质。每类蛋白质的含量以该类蛋白质电泳条带光密度占其整条泳道光条带密度的百分数表示[19]。不同处理豆粕蛋白质亚基分布情况见表3。
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图1 未发酵豆粕、发酵豆粕和加蛋白酶发酵豆粕SDS-PAGE电泳图
Fig.1 Electrophoresis of non-fermented soybean meal, fermented soybean meal and fermented soybean meal with protease supplementation |
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表3 不同处理豆粕蛋白质亚基分布情况
Table 3 Distribution of protein subunit in soybean meals with different treatments %
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由图1及表3可知，未发酵豆粕组大分子蛋白质含量为18.25%，发酵48 h后显著减少，其中加蛋白酶发酵豆粕组大分子含量显著低于未发酵豆粕组和发酵豆粕组(P<0.05)，发酵豆粕组显著低于未发酵豆粕组(P<0.05)。未发酵豆粕组的中分子蛋白质含量显著高于加蛋白酶发酵豆粕组和发酵豆粕组(P<0.05)，但经发酵的2组之间差异不显著(P>0.05)。小分子蛋白质含量加蛋白酶发酵豆粕组显著高于发酵豆粕组(P<0.05)，而发酵豆粕组显著高于未发酵豆粕组(P<0.05)。
发酵温度、pH是微生物活跃程度的直接衡量指标，由于微生物大量繁殖，各料水比发酵温度均在24 h时最高，之后随着底物中可利用碳水化合物等减少，微生物活性逐渐减弱，发酵温度缓慢降低。该试验pH缓慢下降是因为多菌种(不含乳酸菌)发酵并不会使pH大幅度下降，但较低的pH说明微生物对底物分解更彻底，产生更多的有益代谢产物。
底物初水分含量是一个重要的生产指标，随着发酵过程的进行，微生物不断将底物中的碳水化合物等结构支撑物质分解，造成底物稀湿粘连[17]。由于发酵后水分含量会极大程度增加烘干成本，实际生产中常选用较低的料水比。
粗蛋白质含量是发酵豆粕的重要商品价值指标，豆粕经微生物处理后蛋白质绝对含量不变或略有下降。但由于碳水化合物被分解导致粗蛋白质含量相对上升[18]。本试验4个料水比发酵48 h其粗蛋白质含量提高程度较相似发酵条件下陈中平等[18]采用单一米曲霉发酵的结果略高，这可能是由于多菌种比单一米曲霉发酵能力更强。Zamora等[19]对豆粕发酵处理后粗蛋白质含量由43.4%上升至45.4%，与本试验结果较为一致。
真蛋白质(酸不溶蛋白)是豆粕蛋白质中未被微生物分解的部分以及菌体蛋白，而另一部分经微生物分解后形成的小肽、氨基酸及其他非蛋白氮能溶于三氯乙酸中。本试验中真蛋白质含量呈上升趋势，这与许多真蛋白质含量降低的报道相反，但是与陈京华[20]利用米曲霉发酵豆粕后真蛋白质含量上升程度一致，刘稳结等[21]利用多菌种发酵豆粕也得到真蛋白质含量升高的趋势。其可能原因是微生物一方面将真蛋白质分解为小肽、游离氨基酸和氨氮，另一方面又将这些分解物合成菌体蛋白，加之微生物对干物质的消耗，三者相互动态作用使真蛋白质相对含量不稳定。本试验的真蛋白质含量先升高可能是由于菌体蛋白的大量合成以及底物中碳水化合物被利用，发酵后期随着氨基酸、小肽及非蛋白氮增加，真蛋白质含量降低。
本试验中料水比1∶ 0.6组发酵后粗蛋白质含量和pH指标都优于料水比1∶ 0.4组，但由于料水比1∶ 0.6组挥发性盐基氮含量显著高于其他料水比组，而挥发性盐基氮含量反映了发酵豆粕的氨基酸损失和腐败程度，该值应越低越好，所以选择1∶ 0.4为推荐发酵料水比。本试验选取48 h为推荐发酵时间，这与Sardjono等[22]研究证明豆粕发酵48 h米曲霉分泌的蛋白酶活性达到最高水平而后变弱的结论一致。
微生物对豆粕的发酵作用主要依赖于其所产生的各种酶，特别是各种蛋白酶。理论上添加外源蛋白酶协同微生物发酵豆粕能够缩短发酵时间，产生更好的发酵效果。本试验选取上述推荐发酵条件做加酶与不加酶发酵的对照试验，结果显示加蛋白酶发酵对豆粕粗蛋白质含量影响不显著，而显著降低了真蛋白质含量和显著升高了游离氨基酸的含量。这说明加蛋白酶发酵使豆粕中更多的蛋白质降解为酸溶性蛋白。试验组豆粕的干物质含量显著降低，这可能是蛋白酶对豆粕蛋白的降解为微生物提供了更多小肽、氨基酸等容易利用的氮源物质，使微生物生长更旺盛，将更多碳水化合物分解为自身代谢提供碳架和能量。加蛋白酶使发酵豆粕中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量略有下降但不显著，这可能是因为豆粕中纤维含量较低，该类发酵微生物对碳源的利用主要来自于淀粉、多糖等碳水化合物，而对纤维的改造程度不大。
豆粕中主要抗原蛋白包括大豆球蛋白、α-伴大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和γ-伴大豆球蛋白。其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白占大豆总蛋白的70%以上[23, 24]，经SDS-PAGE胶电泳分离后其条带显示未发酵豆粕组的各抗原蛋白条带颜色均深于加蛋白酶发酵豆粕组和发酵豆粕组。条带光密度分析结果显示加蛋白酶发酵豆粕组较发酵豆粕组β-伴大豆球蛋白的α亚基和α′亚基(大分子蛋白质)含量显著降低，小分子蛋白质含量显著提高。这说明添加蛋白酶发酵能够有效分解豆粕中大分子蛋白质，减少抗营养因子，提高其营养价值。
① 利用复合益生菌(酿酒酵母∶ 米曲霉∶ 枯草芽孢杆菌=5∶ 1∶ 2)，模拟工厂生产的发酵条件，综合考虑生产成本因素，选取料水比1∶ 0.4、发酵48 h为发酵豆粕生产的推荐工艺参数。
② 在推荐发酵条件下添加外源蛋白酶协同微生物发酵可进一步改善发酵豆粕蛋白质品质，显著降低抗营养因子含量，提高发酵豆粕可利用氮的质量。
| [1] | 俞晓辉,姚文,施学仕,等.大豆发酵蛋白替代鱼粉对断奶仔猪生产性能和肠道主要菌群的影响[J]. 动物营养学报,2008,20(1):46-51.(1) |
| [2] | 夏素银,王成章,严学兵,等.发酵蛋白饲料替代豆粕对肉仔鸡生长性能养分消化率及肠道菌群的影响[J]. 动物营养学报,2010,22(2):352-357. (1) |
| [3] | SARKAR P K,JonES L J,CRAVEN G S,et al.Amino acid profiles of kinema,a soybean fermented food[J]. Food Chemistry,1997,59(1):69-75. (1) |
| [4] | HONG K J,LEE C H,KIM S W.Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and soybean meal[J]. Journal of Medical Food,2004,7(4):430-436. (1) |
| [5] | 余勃.发酵豆粕生产大豆多肽研究[J].生物工程,2007,28(2):189-192. (1) |
| [6] | 冯杰,刘欣,卢亚萍,等.微生物发酵豆粕对断奶仔猪生长、血清指标及肠道形态的影响[J]. 动物营养学报,2007,19(1):40-43. (1) |
| [7] | 陈文静.新型发酵豆粕在乳仔猪饲粮中应用效果研究.硕士学位论文.扬州:扬州大学,2004. (1) |
| [8] | KIERS J L,MEIJER J C.Effect of fermented soyabeans on diarrhea and feed efficiency in weaned piglets[J].Journal of Applied Microbiology,2003,95(3):545-552. (1) |
| [9] | 王晓翠,王浩,李杰.发酵豆粕在断奶仔猪生产中的应用研究[J]. 动物营养学报,2011,23(6):919-923. (1) |
| [10] | 刘欣,刘淑全.微生物发酵豆粕对仔猪生长性能及免疫功能的影响[J]. 粮食与饲料工业,2007(4):39-40. (1) |
| [11] | 方乐,葛向阳,汤江武,等.菌酶协同处理豆粕制备饲用小肽的研究[J]. 中国饲料,2011(5):17-20. (1) |
| [12] | ANDREAS K G,ANNETTE L P,LEDA R C,et al.Lipase production by Penicillium restrictum in solid-state fermentation using babassu oil cake as substrate[J]. Process Biochemistry,1999,35:85-90. (1) |
| [13] | 张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术[M].2版.北京:中国农业大学出版社,2004. (1) |
| [14] | 朱燕,夏玉宇.饲料品质检验[M]. 北京:化学工业出版社,2004. (1) |
| [15] | 胡永娜,李爱科,王之盛,等.微生物固态发酵菜籽粕营养特性的研究[J]. 中国粮油学报,2012,27(3):76-80. (1) |
| [16] | SADEGHI A A,NIKKHAH A,SHAWRANG P,et al.Protein degradation kinetics of untreated and treated soybean meal using SDS-PAGE[J].Animal Feed Science and Technology,2006,126(1):121-133. (1) |
| [17] | 陈洪章,徐建.现代固态发酵原理及应用[M].北京:化学工业出版社,2004. (1) |
| [18] | 陈中平,周安国,王之盛,等.米曲霉发酵豆粕营养特性的研究[J]. 中国畜牧杂志,2011,47(9):40-44. (1) |
| [19] | ZAMORA R G,VEUM T.Whole soybeans fermented with Aspergillus oryzae and Rhizopus oligosporus for growing pigs[J].Journal of Animal Science,1979,48(1):63-68. (2) |
| [20] | 陈京华.米曲霉AS3.951发酵豆粕对大菱鲆摄食生长的影响[J]. 中国农学通报,2009,25(2):277-282. (1) |
| [21] | 刘稳结,王际辉,叶淑红,等.高蛋白豆粕饲料发酵条件研究[J]. 中国酿造,2010(2):123-127. (1) |
| [22] | SARDJONO E S R,ZHU Y,KNOL W.Comparison of fermentation profiles between lupine and soybean byAspergillus oryzae and Aspergillus sojae in solid-state culture systems[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,1998,46:3376-3380. (1) |
| [23] | YAKLICH R W.β-conglycinin and glycinin in high-protein soybean seeds[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,2001,49(2):729-735. (1) |
| [24] | THANH V H,SHIBASAKI K.Major proteins of soybean seeds.A straightforward fractionation and their characterization[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1976,24(6):1117-1121. (1) |
