凌宇恒,吴淑妃,柯才焕,赵 晶*
(厦门大学海洋与地球学院,福建 厦门 361102)
摘要：对一株来自于杂色鲍(Haliotis diversicolor)肠道并经证实具有显著促进其生长及免疫活性的同温层芽孢杆菌 (Bacillus stratosphericus)A3440进行培养基及发酵条件的优化研究，为该益生菌应用于鲍及其他水产动物的健康养殖奠定基础。以细菌芽孢率和蛋白酶活力为检测指标，采用单因素试验和正交设计试验优化发酵培养基组分及发酵条件。结果显示，该菌最佳发酵配方为，蛋白胨7 g/L、酵母膏7 g/L、NaCl 20 g/L、CaCl2 0.2 g/L；最佳发酵条件为初始pH为9.0、培养温度30 °C、种子液接种量8 %、装液量30 mL/250 mL、培养时间24 h。优化后芽孢率为94.3 %，较出发培养基提高8.77 %；蛋白酶活力为294.44 U/mL，较出发培养基提高76.67 %。
关键词：同温层芽孢杆菌；发酵培养基；发酵条件；蛋白酶活力；芽孢率
中图分类号:Q939.9 文献标志码: A
随着对动物蛋白需求的增大，水产养殖业作为世界发展最快的食品供给领域，受到越来越多的关注，具有广阔的前景[1]。亚洲的水产养殖业近几十年迅猛发展，目前产量已占全球的90 %[2]。我国的鲍养殖研究开始于20世纪70年代，目前我国已成为了世界最大的养鲍大国， 2013年中国鲍养殖总产量达11.0万吨，其中福建省8.85万吨[3-4]，创造了巨大的经济价值与社会效益。然而，随着鲍养殖业的快速发展，养殖规模的不断扩大、集约化程度提高以及沿海水质的恶化，导致鲍病害日益频繁，危害了鲍的生长发育以及鲍养殖业的健康发展[5-7]。抗生素的应用在一定程度上能够有效应对水产养殖病害的发生和蔓延，但长期使用将会导致一系列副作用。如抗生素残留水平升高、病原菌抗药性增强、破坏肠道有益菌群的微生态环境等，且抗生素在水生动物体内的富集也会对人类的健康造成危害 [8-10]。因此，开展鲍健康养殖方式势在必行。益生菌能够有效改善水环境、调节养殖动物体内微生态平衡、提高宿主免疫水平和消化酶活性，在促进水产养殖对象生长发育与预防病害中发挥重要作用，成为水产养殖业的研究应用焦点[11]，益生菌取代抗生素也成为未来的发展趋势[12]。
1974年，Parker首次定义益生菌为有助于肠道菌群平衡的微生物和物质[13]。1986年，Kozasa首次将益生菌应用于水产养殖中[14]。此后，益生菌水产养殖研究迅速发展，在作为饲料微生态添加剂和水体微生态调节剂上都发挥巨大的作用。2001年，食品农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)完善了它的定义，将益生菌定义为有活性的微生物，当其适量施用时，能够赋予宿主健康[15]。目前已经发现了多种可以用于养殖的益生菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，这些益生菌的来源通常是宿主动物的消化道 [16]。芽孢杆菌是一种重要的益生菌，革兰氏染色阳性，大多为好氧或兼性厌氧，具有极强的产孢子的能力。其分解转化和适应能力强，可代谢产生蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶类，提高养殖对象对饲料的吸收与转化，能够降解水体中的氨氮、亚硝酸盐，抑制病原菌的生长 [17-18] 。在过去三十年，芽孢杆菌属已扩展至超过100种，但可以用作养殖益生菌的菌种并不多 [19]。目前，益生菌在水产养殖中的应用主要集中在鱼类、甲壳类和双壳类，关于鲍等腹足类的益生菌研究相对较少，许多在鲍养殖中使用与研究的益生菌多为从其它水生动物或水体中提取，效果并不明显。
同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440是从健康杂色鲍(Haliotis diversicolor)肠道分离筛选获得的，研究发现其具有5种消化酶活性，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、褐藻酸钠酶和纤维素酶，其中以蛋白酶活力最强，且通过初步检测其安全性，发现不产生溶血素，并且在菌株浓度1×108 cfu/g (鲍湿重)时对鲍无明显的毒害作用，可以作为益生菌应用于鲍养殖[20]。本研究以芽孢产率和蛋白酶活力为指标，通过单因素试验和正交试验对同温层芽孢杆菌A3440菌株产芽孢和蛋白酶活力的发酵条件优化，为工业化生产提供理论依据与参考。
1 材料与方法
1.1 菌株
同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440，由厦门大学海洋与地球学院分离保存 。
1.2 基础发酵培养基和种子培养
以2216E液体培养基作为基础发酵培养基：蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、磷酸高铁0.01 g/L、过滤陈海水1 L。将菌株A3440接种于100 mL 2216E液体培养基，200 r/min、30 °C摇床培养20 h后作为种子培养液备用。
1.3 实验方法
1.3.1 生长曲线的测定
为选择合适生长时期的菌液作为种子液，进行A3440生长曲线的初步测定。将种子液接种于100 mL基础培养基，接种量为1 %，200 r/min、30 °C摇床培养。每隔2 h取样，以基础培养基为空白，测定发酵液在630 nm条件下的吸光度。以培养时间为横坐标，OD630为纵坐标，绘制A3440的初步生长曲线，以选择对数生长期为最佳接种时间。
1.3.2 芽孢率的测定
采用稀释平板计数法，选取106、107、108三个浓度梯度，每个梯度涂布3个平板，30 °C培养48 h后进行计数。将菌液80 °C水浴10 min后稀释平板计数，按以下方程式计算A3440芽孢率。
芽孢率 = 80 °C水浴后活菌数 / 发酵液活菌数。
1.3.3 蛋白酶活力的测定
用100 μg/mL的酪蛋白标准溶液配置标准系列溶液，酪蛋白终浓度(μg/mL) 0、10、20、30、40、50，分别使用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定其OD630，绘制标准曲线。以蒸馏水作为空白对照。标准曲线见图1。
图1 酪蛋白标准曲线
Fig.1 Standard curve of casein
参照张映京等的方法[21]测定蛋白酶活力。取发酵菌液1 mL，在8 000 r/min离心15 min，分别取0.2 mL加入2个1.5 mL离心管，标记为试验组与空白组。40 °C水浴2 min，空白组加入0.4 mol/L三氯乙酸0.4 mL。各组加入1 %酪蛋白0.8 mL，40 °C保温20 min。试验组加入0.4 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，保温20 min。离心取上清，稀释100倍。取20 μL于酶标板，以20 μL蒸馏水作为对照。使用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定其OD630。在上述反应条件下,每min水解酪蛋白产生1 μg Tyr的酶量为一个酶活力单位.
计算公式：
酶活力(U/mL)=△OD×1 mL×N/(k×20 min)
其中△OD为试验组与空白组OD630差值；N为酶液的稀释倍数；k为标准曲线斜率。
1.3.4 培养基组分的选择
在其他培养条件不变的情况下，将基础培养基中的蛋白胨替换为等量的淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为菌株提供碳源，以不加碳源的培养基作为阴性对照；将基础培养基中的酵母膏替换为等量的牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵为菌株提供氮源，以不加氮源的培养基作为阴性对照；将基础培养基中的陈海水替换为1 %NaCl、1 %KCl、1 %MgSO4、1 %CaCl2为菌株提供无机盐，以不加无机盐的培养基作为阴性对照；将基础培养基中的磷酸高铁替换为等量Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+为菌株提供金属离子，以不加金属离子的培养基作为阴性对照。每一步实验都以基础培养基作为阳性对照。探究最优碳源、氮源、无机盐和金属离子。
1.3.5 培养基组分的正交优化
根据以上的实验结果，选择最优碳源、最优氮源、最优无机盐、最优金属离子四因素四水平设计正交试验。正交试验因子水平如表1所示。
表1 A3440正交试验因子水平表
Tab.1 Orthogonal test factor table of A3440
水平 碳源浓度/% 氮源浓度/% 无机盐浓度/% 金属离子浓度/%
1 0.1 0.1 0.10 0.005
2 0.4 0.4 0.15 0.010
3 0.7 0.7 0.20 0.015
4 1.0 1.0 0.25 0.020
1.3.6 发酵条件的选择
根据正交试验结果配置发酵培养基。在其他培养条件不变的情况下，分别在20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C五种温度培养，确定最优培养温度；分别以1 %、3 %、5 %、8 %、10 %接种量加入种子液，确定最优接种量；在250 mL锥形瓶中分别加入20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL培养基，确定最优装液量。将培养基的基础pH分别调节至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，确定最优初始pH。
1.3.7 数据处理
数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，通过Duncan氏多重比较分析组间差异显著性，显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 A3440种子液培养时间的确定
对A3440进行生长曲线的初步绘制(图2)，结果表明在0到10 h，菌体生长速度缓慢；在10 h到28 h，菌体生长速度加快；从28 h开始，菌体生长速度逐渐减小，进入平台期。因此选择处于生命力旺盛的对数期的菌体作为种子液，选择24 h~26 h作为种龄。
图2 A3440 生长曲线
Fig.2 Growth curve of A3440
2.2 培养基组分对A3440蛋白酶活力、生物量与芽孢率的影响
碳源优化实验中，以蛋白胨、蔗糖、乳糖作为碳源，芽孢率较大，都在85 %以上，但蛋白胨作为碳源，生物量和蛋白酶活力都显著高出其他组(P<0.05)，因此选择蛋白胨作为最优碳源 (图3-A、图4-A)。氮源优化实验结果显示以酵母膏、乙酸铵、牛肉膏作为氮源，芽孢率较大，都在80 %以上，但酵母膏作为氮源，生物量和蛋白酶活力都高于其他组，其中生物量对比其他组差异显著(P<0.05)，因此选择酵母膏作为最优氮源(图3-B、图4-B)。无机盐优化实验各实验组芽孢率并无显著差异(P>0.05)，以NaCl作为无机盐，生物量显著高于其他组(P<0.05)，且NaCl作为无机盐时，发酵液的蛋白酶活力最强，因此选择NaCl作为最优无机盐(图3-C、图4-C)。金属离子优化试验中，以Fe3+和Ca2+作为金属离子时，发酵液蛋白酶活力较高，但并无显著性差异(P>0.05)，以Ca2+作为金属离子时，有最高的生物量和芽孢率，因此选择Ca2+作为最优金属离子 (图3-D、图4-D)。
(a)：不同碳源；(b)：不同氮源；(c)：不同无机盐；(d)：不同金属离子
图3 不同培养基组分对A3440蛋白酶活力的影响
Fig.3 Effect of different culture medium component on protease activity of A3440
(a)：不同碳源；(b)：不同氮源；(c)：不同无机盐；(d)：不同金属离子
图4 不同培养基组分对A3440生物量和芽孢率的影响
Fig.4 Effect of different culture medium component on yield spore production of A3440
2.3 A3440培养基组分的正交优化
正交试验极差分析表明(表2)，极差值R蛋白胨>RNaCl>R酵母膏>RCaCl2，可知蛋白胨作为主要的影响因素，NaCl次之。由均值k得出， 蛋白胨0.7 %、酵母膏0.7 %、NaCl 2.0 %、CaCl2 0.02 %为最佳培养基组合，以此进行发酵条件优化。
表2 A3440正交试验结果
Tab.2 Orthogonal test result of A3440
蛋白胨浓度/% 酵母膏浓度/% NaCl浓度/% CaCl2浓度/% 蛋白酶活力/(U•mL-1)
1 0.1 0.1 1.0 0.005 88.89
2 0.1 0.4 1.5 0.010 155.56
3 0.1 0.7 2.0 0.015 200.00
4 0.1 1.0 2.5 0.020 205.56
5 0.4 0.1 1.5 0.015 183.33
6 0.4 0.4 2.0 0.020 211.11
7 0.4 0.7 2.5 0.005 211.11
8 0.4 1.0 1.0 0.010 194.44
9 0.7 0.1 2.0 0.005 238.89
10 0.7 0.4 2.5 0.010 227.78
11 0.7 0.7 1.0 0.015 222.22
12 0.7 1.0 1.5 0.020 211.11
13 1.0 0.1 2.5 0.015 227.78
14 1.0 0.4 1.0 0.020 216.67
15 1.0 0.7 1.5 0.005 222.22
16 1.0 1.0 2.0 0.010 227.78
k1 162.50 184.47 180.56 190.28
k2 200.00 202.78 193.06 201.39
k3 225.00 213.89 219.44 208.33
k4 223.61 209.72 218.06 211.11
R 62.50 29.17 38.89 20.83
注：k1~k4表示各因素水平下蛋白酶活力的平均值；R表示极差。
2.4 培养条件对A3440蛋白酶活力、生物量与芽孢率的影响
在30 °C和35 °C时，发酵液的蛋白酶活力最高，但随着温度的升高，发酵液的芽孢率不断降低，35 °C时的芽孢率显著低于30 °C(P<0.05) (图5-A、图6-A)。接种量在3 %~8 %时，蛋白酶活力较高，但接种量为5 %时，生物量偏低，显著低于接种量8 %组(P<0.05)(图5-B、图6-B)。装液量为20 mL~40 mL时，各试验组的蛋白酶活力、生物量与芽孢率较高，但并无显著性差异(P>0.05)，装液量为30 mL时，具有最高的生物量和芽孢率(图5-C、图6-C)。初始pH值为7.0~10.0时，发酵液具有最高的蛋白酶活力和生物量，显著高于其他试验组(P<0.05) ，其中当初始pH为9.0时，蛋白酶活力和芽孢率最高(图5-D、图6-D)。综上所述，最优培养条件为初始pH为9.0、培养温度30 °C、种子液接种量8 %、装液量30 mL/250 mL。
所有发酵培养基和培养条件优化后，芽孢率为94.3 %，较出发培养基提高8.77 %；蛋白酶活力为294.44 U/mL，较出发培养基提高76.67 %。
(a)：不同温度；(b)：不同接种量；(c)：不同装液量；(d)：不同初始pH值
图5 不同培养条件对A3440蛋白酶活力的影响
Fig.5 Effect of different culture conditions on protease activity of A3440
(a)：不同温度；(b)：不同接种量；(c)：不同装液量；(d)：不同初始pH值
图6 不同培养条件对A3440生物量和芽孢率的影响
Fig.6 Effect of different culture conditions on yield spore production of A3440
3 讨论
幼鲍饵料中含有大量的蛋白成分，芽孢杆菌进入肠道后，产生较强活性的蛋白酶，有助于幼鲍对饵料的消化，进而提高饵料消化率，促进幼鲍的生长 [22]。相比于动物蛋白酶、植物蛋白酶和真菌蛋白酶，微生物蛋白酶更多的被运用于工业生产中。芽孢杆菌具有快速产酶能力，其生产的碱性蛋白酶具有很高的蛋白水解活性和在碱性条件下的稳定性 [23-24]，几乎包括了能够应用于生物技术的所有特征 [25]。因此本研究选择蛋白酶活力作为一项指标。
在益生菌投喂过程中，必须保证足够的活菌量。在不良运输与加工条件下，芽孢杆菌能形成芽孢，使其具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存的特点 [26]。因此本研究选择芽孢率和作为另一项指标。
在培养基优化实验中,发现以蛋白胨和酵母膏作为碳、氮源时，具有最高的蛋白酶活力与芽孢率。蛋白胨的主要成分为氨基酸、多肽，一般蛋白质含量会达到80 %以上，糖类含量较低；酵母膏中含有多种氨基酸、肽类、水溶性纤维素。说明同温层芽孢杆菌A3440在丰富氨基酸、多肽培养基条件下有更强的活性。
从培养条件优化结果可以看出，同温层芽孢杆菌A3440的适合培养范围较广。装液量对蛋白酶活力和芽孢率都呈负相关性，装液量反映了菌株的通气量需求，表明同温层芽孢杆菌A3440为好氧菌，在实际生产过程中应注意适当提高通气量。同温层芽孢杆菌A3440的培养pH值为9.0，与郎双静[27]、舒丹[28]、胡承[29]的实验结果相近，推测同温层芽孢杆菌A3440为产碱性蛋白酶菌株。多个实验结果可以看出，同温层芽孢杆菌A3440产蛋白酶活力与芽孢率的最适条件接近，但并不一致，其实际生产中的最适条件有待进一步的研究。
本研究对同温层芽孢杆菌A3440菌株产芽孢率和蛋白酶活力的发酵条件进行了优化，在优化条件下芽孢率为94.3 %，较出发培养基提高8.77 %；蛋白酶活力为294.44 U/mL，较出发培养基提高76.67 %。研究结果为进一步放大优化以及工业化生产奠定基础。
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Optimization of Culture Medium and Fermentation Conditions of Probiotics Bacillus stratosphericus A3440 from farmed abalone
Ling Yu-heng, Wu Shu-fei, Ke Cai-huan, Zhao Jing*
(College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)
Abstract: Bacillus stratosphericus A3440 which was isolated from farmed abalone Haliotis diversicolour has been verified as probiotic to improve growth rate and disease resistance of abalone. based on high yield spore production and strong protease activity, the culture medium and fermentation conditions of B.stratosphericus A3440 were optimized by single factor test and orthogonal experiments. The results showed that the optimized medium component of A3440 were peptone 7 g/L, yeast extract 7 g/L, NaCl 20 g/L, CaCl2 0.2 g/L and the optimized culture conditions were initial pH 9.0, temperature 37 °C, inoculation amount 8 %, liquid volume 30 mL/250 mL, cultivated for 24 h. Under the optimized fermentation conditions, the spore yield was up to 94.3 % which increase 8.77 % than that from initial medium and the protease activity was 294.44 U/mL which increase 76.67 % than that from initial culture conditions.
Key words: Bacillus stratosphericus; culture medium; fermentation conditions; protease activity; spore yield
