苯环芳烃,对生物体有毒性,该类化合物的微生物降解一直是国际研究热点。现已发现很多细菌、真菌和放线菌均能依靠其产生的酶,对苯环芳烃进行转化或降解。很多微生物还能生长在以苯、甲苯等作为唯一碳源和能源的培养基里[1],微生物对这些结构相对简单的苯环芳香族化合物有很强的耐受力,能够启动自身调节系统,来抵抗这些化合物的“毒性”,并实现解毒过程。总体而言,目前有关苯环芳烃的微生物降解研究文献很多,但主要是生物学家和环境学家在开展相关研究,且工作集中于微生物的筛选、降解产物和降解途径的分析、酶以及相关基因的研究[2]。
苯环芳烃的微生物降解可分为有氧降解和厌氧降解。有氧降解以分子氧作为最终电子受体,而厌氧降解以除氧以外的物质,如硝酸盐、硫酸盐、二氧化碳或Fe3+等作为最终电子受体。常规培养下的喜氧微生物能产生混合功能的氧化酶或双氧化酶,苯环化合物首先在氧分子和酶的作用下形成邻苯二酚或其衍生物的共同代谢中间体,然后再进一步经过氧分子及开环酶的作用形成直链的分子,最后再进入三羧酸循环。例如,苯的降解主要是由双加氧酶攻击苯环,形成邻苯二酚,邻苯二酚进一步通过间位或邻位双加氧酶的作用而产生粘康酸半醛或粘康酸,之后继续降解。甲苯的降解一般是通过加氧酶的作用,在2,3碳位上形成二酚,再由2,3-双加氧酶或1,2-双加氧酶将其开环裂解。也可以先发生甲基的羟基化、羧基化、再发生苯环的羟基化(Scheme 1)[3]。在苯环芳烃的降解过程中,微生物加氧酶,如单加氧酶、双加氧酶等处于特异性地高活性状态,这些酶在生物催化转化、有机合成化学中具有重要的应用前景。
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Scheme 1 The main microbial biodegradated intermediate products of benzene and toluene |
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一类物质,两个芳环之间通过三碳链相连,具有C6-C3-C6基本母体结构。很多黄酮类化合物具有重要生理活性,如治疗心血管系统疾病、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛、抗疲劳、抗衰老、以及保肝活性,此外还有降压、降血脂、提高机体免疫力等[4]。黄酮类化合物的药理活性与其结构密切相关,酚羟基的数目决定了黄酮化合物抗氧化活性的强弱,为获得高活性黄酮抗氧化剂,需对先导化合物进行羟基化修饰。在目前,传统的化学合成方法还难以实现碳氢化合物中非活泼性C—H键的直接羟基化反应,即使是最简短的途径至少3步才能合成[5],然而,采用单一的羟基化酶或者整个微生物细胞进行生物催化加氧是实现选择性羟基化反应的一种有效方式。由于酶的特异性,可在底物某一位点选择性引入羟基,提高活性成分的溶解度和生物利用度。目前对黄烷酮的微生物转化研究很少,仅有的报道[6]是利用野生型菌株 Penicillium chermesinum 113对黄烷酮进行发酵培养,得到转化产物4'-羟基黄烷酮,但该转化产物能发生进一步转化得到2',4-二羟基二氢查耳酮(2',4-dihydroxydihydrochalcone),反应9 d后,两产物的转化率分别为11.8%和36.5%。Golub等[7]报道通过受体结合的虚拟筛选和分子对接表明4'-羟基黄酮对人蛋白激酶CK2具有高抑制活性,能作为治疗癌症、病毒感染、炎症等疾病的蛋白激酶导向药物。
本研究发现在海洋真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum的培养基中添加苯和甲苯,能诱导真菌对黄烷酮的羟基化转化,得到唯一的转化产物4'-羟基黄烷酮(Scheme 2)。该方法具有成本低、条件易控、效率高等特点,在酶促进的生物转化反应中具有潜在的应用价值。
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Scheme 2 Scheme 2 Biotransformation of flavone and the hydroxylated product |
海洋真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum,分离自海南三亚西岛海域长棘海星 Acanthaster planci的体内,分离后的菌种在-80 ℃保存。
岛津LC20AT二元梯度高效液相色谱仪(日本岛津公司),配备LC20AT泵和SPD-20A检测器。使用分析型色谱柱Inertsil® ODS-SP,5 μm,250×4.6 mm;制备型色谱柱Shim-pack PRC-ODS,15 μm,250 mm×20 mm。Avance II 400 MHz型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)。
黄烷酮,分析纯;乙腈,HPLC级,均购于Sigma公司。乙酸乙酯为市售AR 试剂。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏为生化试剂,购于广东环凯微生物科技有限公司。
以葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,酵母膏2 g,海水1 L,用1 mol/L HCl或者30%NaOH溶液调整pH值至7.5为真菌培养基配方(简称GPY)。取96个1000 mL的干净锥形瓶,每瓶分装500 mL液体培养基,灭菌。将培养瓶均分成6组,每组16瓶。1~3组接入真菌 Pseudallescheria boydii,4~6组则接入真菌 Trichoderma erinaceum。真菌在28 ℃下120 r/min摇瓶培养7 d后,每瓶加入100 mg黄烷酮,第2和5组的各瓶再添加200 mg苯,第3和6组每瓶则添加200 mg甲苯,继续摇瓶培养,并每隔1 d每实验组收取1 L(2瓶)培养液。各组真菌培养液用等体积乙酸乙酯提取3次,合并提取液,旋转蒸发浓缩得到提取物。
HPLC分析采用线性梯度洗脱程序,乙腈-水作为洗脱剂,流速0.5 mL/min。0~10 min,30%乙腈-70%水;40 min,100%乙腈;60 min,100%乙腈。各化合物的纯化则选用制备型色谱柱,乙腈-水(60∶40,体积比)作为洗脱剂。黄烷酮的转化率和回收率根据制备液相所得的化合物经干燥后再称重计算所得到。
4'-羟基黄烷酮,淡黄色针状固体,分子式C15H10O3。其NMR数据如下:1H NMR(400 MHz,CDCl3,TMS), δ:8.03(d, J=7.2 Hz,H-5),7.97(d, J=8.0 Hz,H-2',H-6'),7.81(dd, J=8.0,7.2 Hz,H-7),7.75(d, J=8.0 Hz,H-8),7.48(dd, J=7.2,7.2 Hz,H-6),6.94(d,J=8.0 Hz,H-3',H-5'),6.87(s,H-3);13C NMR(100 MHz,CDCl3,TMS), δ:176.8(C-4),163.0(C-2),155.6(C-8a),134.0(C-7),128.3(C-2',C-6'),125.3(C-6),124.7(C-5),123.3(C-4a),121.6(C-1'),118.3(C-8),115.9(C-3',C-5'),104.8(C-3)。该波谱数据与文献值基本一致[8]。
黄烷酮:IR(KBr), νmax/cm-1:3060,1647,1618,1607,1571,1496,1466,1450,1377,1226,1129,1030;1H NMR(400 MHz,CDCl3,TMS), δ:8.22(d, J=7.8 Hz,1H),7.91(dd, J=7.8,1.2 Hz,2H),7.69(dddd, J=7.8,7.8,1.2,1.2 Hz,1H),7.56(d,J=8.4 Hz,1H),7.52(dd, J=8.4,7.8,1.2 Hz,1H),7.51(ddd, J=7.8,7.8,1.2 Hz,2H),7.41(ddd, J=7.8,7.8,1.2 Hz,1H),6.82(s,1H);13C NMR(100 MHz,CDCl3,TMS),δ:177.1,162.0,155.1,132.8,130.7,130.6,128.1,125.2(2×C),124.6,124.3,123.0,117.2,106.5,106.4。
将各实验组的乙酸乙酯提取物用乙腈溶解,以乙腈-水为梯度洗脱剂,进行 HPLC分析。黄烷酮标样的HPLC分析其保留时间为34.8 min。对比黄烷酮标样的HPLC分析结果,在没有添加苯和甲苯的实验组,真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum对黄烷酮不发生转化;而在添加了苯和甲苯的培养组,在保留时间为28.5 min处多出一个峰,经制备分离纯化,结构鉴定,确定其为4'-羟基黄烷酮(图1)。
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图1 海洋真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum对黄烷酮的转化产物HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of the biotransformation products of flavone by Pseudallescheria boydii and Trichoderma erinaceum a.flavone; b.Pseudallescheria boydii; c.Pseudallescheria boydii+benzene; d. Pseudallescheria boydii+toluene; e.Trichoderma erinaceum; f.Trichoderma erinaceum+benzene; g.Trichoderma erinaceum+toluene |
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图2 黄烷酮的转化率随时间的变化关系曲线Fig.2 Curves of transformation yields of flavone changing with the time a.Pseudallescheria boydii+toluene;b.Pseudallescheria boydii+benzene; c.Trichoderma erinaceum+benzene; d.Trichoderma erinaceum+toluene |
在开始转化的1~5 d内,真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum对黄烷酮的转化率随时间有明显的增加,5 d后转化率的变化则不明显(图2)。在转化效率的比较上可以看出,真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum对黄烷酮均有较高的转化率。转化至第5 d,真菌 Trichoderma erinaceum在GPY加苯,以及GPY加甲苯的培养条件下,对黄烷酮的转化率高达82%和63%,均高于 Pseudallescheria boydii对黄烷酮的转化产率41%和52%(表1)。这也表明 Trichoderma erinaceum在降解苯的过程中产生的酶对黄烷酮具有较强的转化能力。高转化率也使得转化产品的纯化操作变得更加简单、高效。
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表1 黄烷酮的转化率和回收率Table 1 The transformation yields and the rate of recovery of flavone |
利用海洋真菌 Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum在有毒外源底物苯和甲苯的胁迫下对黄烷酮进行生物转化,能得到高转化率的黄烷酮的C'-4位的羟基化产物,并且转化产物没发生C环裂解现象,羟基化产物单一,副产物少。说明海洋真菌Pseudallescheria boydii和 Trichoderma erinaceum被调节产生的羟基化酶的专属性高。大量研究已发现很多真菌可以将添加的有毒苯环芳香族化合物转化或降解为无毒性的水溶性成分,甚至最终降解为二氧化碳和水。这为培养海洋真菌时添加适量的苯环芳香族化合物作为诱导物应用于真菌生物催化转化反应及其应用提供了实验依据。
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