简介
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优势 · 快速成像，高效鉴定单克隆细胞系
· 准确追踪单个细胞的生长
· 可以在半固体培养基或液体培养基中对细胞成像，实验方案灵活选择
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实验室常规方法通常使用有限稀释进行细胞克隆。但是，这种方法使用液体培养基培养细胞，使追踪细胞变得比较困难或不够准确。因为在处理微孔板的过程中，悬浮细胞容易在孔内发生位置移动（Figure 1）。不能确保不同时间点成像的 是同一个细胞，从而大大降低单克隆验证的准确性。此外，有限稀释有可能在一个孔内加入多个细胞，需要进行额外多次亚克隆来提高单克隆的概率。
使用半固体培养基培养细胞给科研人员提供了一个更快更简单的克隆方法，而且有利于追踪细胞的生长。细胞在半固体培养基中的位置相对固定，在常规实验操作过程中细胞位置不会移动，可以生长成独立单个的细胞克隆。所以，可以在同一个孔内种植多个细胞，而且通过不同时间点成像，能够清晰追踪单个细胞的生长情况，提供单克隆的数字验证数据。
Cloneselec Imager为研究人员提供了一个在半固体培养基中对细胞进行成像的方法。这个系统使用非侵入性检测方法，无需标记细胞直接进行成像，可以对细胞生长情况进行准确定量；进行单细胞来源克隆验证，确保只选择稳定的单克隆用于下游研究。本文通过实际实验验证Cloneselec Imager在CloneMedia™ CHO Growth A半固体培养基中对悬浮CHO-s细胞的成像性能。这种半固体培养基成份经过专门优化，适合各种CHO细胞系的生长。
Figure 1：有限稀释铺板的96孔板同一个孔CHO-s细胞成像图片：使用Cloneselec Imager系统每隔8小时对微孔板进行一次成像。仅仅只是常规的实验操作，细胞已经在两次成像之间发生了移动，黄色标记的是细胞的位置。
实验操作流程
CHO-s细胞培养和成像的操作流程如Figure 2所示。
Figure 2：使用CloneMedia CHO Growth A半固体培养基追踪单个细胞生长实验总体流程图。XP Media CHO Growth A和CloneMedia CHO Growth A两种培养基提供了一个稳定的CHO细胞培养、克隆和筛选的方法；使用Cloneselec Imager进行成像可以进行单克隆的验证和细胞生长的追踪。
CHO-s细胞首先使用XP Media™ CHO Growth A液体培养基进行培养（货号 K8860），培养前添加4mM谷氨酰胺，37°C培养。然后，CHO-s细胞被铺到半固体培养基CloneMedia
CHO Growth A（货号 K8810），铺板密度为500 cells/ml。细胞混匀后按照2ml/well分装到6孔板（Greiner catalog# 657185）。同时也可以加入直径10uM的无菌微珠（Thermo Scientific catalog# G1000B）到半固体培养基中作为成像位置的参照。加入微珠不是上述CHO-s半固体培养过程的必需步骤。
其中，A1孔要加入2ml 50000cells/ml的细胞悬液作为对焦的参照孔，方便确定正确的对焦值。其他的孔各加入2ml 500 cells/ml细胞悬液，然后，200 x g离心5分钟，37°C培养。
CHO-s细胞成像
使用Cloneselec Imager在多个时间点对微孔板进行成像，以提供单克隆的数字图片证据以及追踪细胞生长。每块板分别在Day 0、1、2、7和8几个时间点进行成像。对于Day 0天的成像，微孔板要先在37°C培养4个小时。成像时，先针对A1孔使用autofocus功能，软件自动寻找最优的对焦值，获得整块板最优的成像效果（如Figure 3）。而且，这个对焦值会自动被记录，相同的对焦值会用于其他时间点的成像过程。
Figure 3：Cloneselec Imager系统设置对焦值（A）对焦设置软件界面，Auto Focus按钮用于自动设置对6孔板CHO-s细胞成像的最优对焦值。（B）使用Auto Focus功能，获得的A1孔细胞成像图片。
结果
CHO-s细胞可以在CloneMedia CHO Growth A半固体培养基中生长，形成紧致的球形克隆，非常容易识别。细胞种植密度为500 cells/ml，每孔形成的单个克隆数目在Day8天可以清晰辨认（Figure 4A和4B）。使用半固体培养基有利于单个孔生长出多个独立的克隆，相对有限稀释，需要的微孔板和培养基的数目大大节省。
Figure 4：Cloneselec Imager系统成像获得的CloneMedia CHO Growth A半固体培养基中CHO-s细胞图片：（A）种植密度为500 cells/ml的CHO-s细胞在Day 8天成像获得的整孔图片。（B）孔中部分克隆的放大图片，可以清晰分辨出单个克隆。黄色圈（A）指示的是图B放大显示的部分。
使用Cloneselec Imager软件可以放大单个克隆，通过链接不同时间点的克隆图片可以追踪克隆的生长，验证克隆是否为单克隆。如Figure5 所示，显示了两个克隆的图片。通过 比对两个克隆不同时间点的生长情况，追踪到Day0天时图片，可以确定克隆是否生长于单个或多个细胞。半固体培养基额外加入的微珠（黄色圈标识）可以作为成像位置的参照，以确定每次成像的都是相同的克隆。
Figure 5： CloneMedia CHO Growth A半固体培养基中CHO-s细胞图片：Cloneselec Imager对6孔板在多个时间点成像。在Day 0 天，如图所示可以清晰观察到上图为一个细胞，下图为两个细胞。黄色圈标出的是微珠的位置，用于作为位置参照以确定每次成像的都是同一个克隆
结论
相比使用液体培养基进行有限稀释，使用CloneMedia CHO Growth A半固体培养基培养CHO细胞是一个更加高效准确的克隆方法。半固体培养基可以固定细胞的位置，在常规实验操作过程中，不会影响细胞发生位置移动。这种方法可以更加准确地追踪单个细胞生长为一个克隆。虽然Cloneselec Imager通常用于液体培养基中细胞的成像，但是也可以用于对半固体培养基中细胞的成像，提供了一个更加准确的工具用于追踪细胞的生长以及验证单克隆。
