(北京理工大学生命学院， 北京， 100081)
β-丙氨酸是一种非天然氨基酸，可用于泛酸和泛酸钙等药物的合成。当药品生产企业或检测机构对一个新批次的药物或原料进行检测时，有必要对检测方法进行方法学验证，以确保该检测方法可以从待测样品中检出目标菌。由于药品或原料药物一般具有抗菌活性，方法学验证过程中可能出现阳性对照未检出、或者阳性菌回收率低等情况，样品中生长被药物抑制却未被杀死的微生物造成检测结果值低或无法检出。将被污染的原料稀释后用于生产时，被抑制的微生物有可能大量繁殖造成安全隐患。因此，消除药物的抑菌活性、在检测过程中尽量减少药物抑菌活性对检测结果的影响是药物微生物限度检查中必须要解决的问题。
2010年版药典中有以下四种方法消除抑菌活性：①滤膜法：通过过滤将待测微生物截留在滤膜上，而有抑菌活性的化合物则洗脱通过滤膜，从而将微生物与抑菌物质分离。滤膜法尤其适用于液体或易溶于水的样品，在消除药物抑菌活性的同时还可以对样品进行富集，降低检出限，但是对于溶解度较低的样品，未溶解的部分会被截留在滤膜上，反而增强了抑菌效果。②中和剂法：依据药物化学、生物学性质，选择相应的化合物减小或消除药物的抑菌活性。合适的中和剂应在消除药物抑菌作用的同时不影响微生物的生长，对不同样品应选用不同中和剂并验证，对于有抑菌活性的化合物不一定能筛选出合适的中和剂。③离心法：在500 rpm的低转速下将不溶性的供试品与微生物分离，减小药物在溶液中的含量。主要适用于溶解度较小的化合物，通过低速离心可除去未溶解的样品，但是离心过程可能造成微生物的损失，影响阳性菌的回收率。④培养基稀释法：将样品用培养基进行稀释，使抑菌成分终浓度降低，从而减小抑菌活性。培养基稀释法适用范围广、理论上适用于任何化合物，但是通常使用5-10倍的培养基对样品进行稀释，更高的稀释倍数虽然可以进一步减弱样品的抑菌效果，但是会消耗大量的培养基与人力不适于日常检测，因此不适用于最小抑菌浓度较高的化合物。
实际检测活动中应根据样品特性选择恰当的方法消除抑菌活性，也可以将多种方法联合使用。本实验中选用了培养基稀释法，相比于滤膜法与离心法，操作步骤较简单，且稀释5倍后样品中目标菌回收率可以满足中国药典的要求。
1 材料
1.1 样品
β-丙氨酸批号06202011，由北大方正医药研究院提供。
1.2 实验用培养基及试剂
营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、氯化钠-蛋白胨缓冲液、胆盐乳糖增菌液、MUG培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司，当天配制灭菌后使用。其余试剂购自北京化工厂。
1.3 实验菌株
大肠埃希菌(Escherichia coli)(CMCC(B) 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC(B) 26003)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(CMCC(B) 63501)、白色念珠菌(Candida albicans)(CMCC(F) 98001)、黑曲霉(Aspergillus niger) (CMCC(F) 98003)以上标准菌株均购自中国生物药品制品检定所(第0代)，第2代保存于-80℃：
2 细菌、霉菌及酵母菌计数
2.1 菌液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至营养肉汤培养基中，35℃培养24 h;接种白色念珠菌至改良马丁培养基中，26℃培养48 h。取上述培养物0.1 mL分别接种于10 mL新鲜的培养基中重复培养。吸取1 mL培养产物用无菌的0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50-100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉至改良马丁琼脂斜面培养基中，26℃培养5天，加入5 mL无菌的含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数50-100 cfu的孢子悬液。
2.2 供试液的制备
取β-丙氨酸10 g，加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，37℃水浴5 min以加速溶解，混匀后作为1:10供试液。
2.3 验证方法
2.3.1 试验组使用平皿法计数，取1:10供试液1 mL，加入1 mL 菌浓度为50-100 cfu/mL的试验菌，注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌使用营养琼脂35℃培养48 h，白色念珠菌和黑曲霉使用玫瑰红钠琼脂26℃培养5-7天。
2.3.2 菌液组 使用平皿法计数，取1 mL菌浓度为50-100 cfu/mL的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
2.3.3 供试品对照组 取1 mL供试液，注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，制备2个平皿，测定样品本底菌落数。
2.3.4 稀释剂对照组 用1 mL氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，加入1 mL菌浓度为50-100 cfu/mL的试验菌，按试验组的方法测定其菌落数。
上述试验重复3次。实验结果见表1-3。由表1与表3结果可见，供试品对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有不同程度的抑菌活性，供试品回收率均低于70%。采用培养基稀释法可消除供试品对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用，回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法(0.2 mL/皿)可用于本品的微生物限度检查法中的细菌计数。由表2结果可见，对于黑曲霉和白色念珠菌，在3次独立的平行试验中，各试验组和稀释剂对照组的回收率均大于70%。
表1 直接接种细菌计数及回收率(cfu)
表2 直接接种法霉菌和酵母菌计数及回收率(cfu)
表3 培养基稀释法菌落计数及回收率(cfu)
注*：表中数据为使用培养基稀释法将1 mL供试液以0.2 mL/皿分别加入5个培养皿中计数结果的总和。
3控制菌的检查
3.1 菌液的与供试液的制备
菌液与供试液的制备方法与2细菌、霉菌及酵母菌计数完全相同。
3.2 验证方法
取大肠埃希菌10-100 cfu(菌液组)、1：10的供试液10 mL及大肠埃希菌10-100 cfu(试验组)、10 mL稀释液(稀释剂对照组)分别加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中，于35℃培养24 h。取上述培养物0.2 mL，接种至5 mL MUG培养基管内，35℃培养。于5h、24 h在366 nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察液面颜色。阳性样品应在紫外灯下有荧光，加入靛基质后出现红色，阴性样品无荧光、加入靛基质不变色。实验结果见表4。
表4 控制菌检查结果
注*：“+”表示检出，“-”表示未检出。
4 结论
β-丙氨酸对金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌有抑菌活性，对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉无抑菌活性。使用培养基稀释的方法可以有效减轻β-丙氨酸对金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的抑菌效果。因此，用氯化钠-蛋白胨缓冲液将β-丙氨酸1：10稀释后，采用培养基稀释法进行细菌计数，即将1 mL供试液以0.2 mL/皿分别注于5个平皿内进行菌落计数，以各平皿菌落数之和作为该平行的菌落数报告。由于β-丙氨酸对黑曲霉和白色念珠菌无抑菌作用，所以采用直接接种法进行本品的霉菌和酵母计数。需要注意的是即使采用了培养基稀释法，枯草芽孢杆菌的回收率最小值也仅为71%，虽然符合2010年版药典3次平行回收率均大于70%的规定，但是抑菌效果依然存在，必要时仍需改进检测方法以消除抑菌效果的影响。
1通讯联系人：屈锋, 教授, 博士生导师, 研究方向为生物医药分析检测. E-mail: qufengqu@ bit.edu.cn.
