(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 00094）2
（西南大学植物保护学院 重庆 400715）1
摘要 本文建立了应用高效液相色谱法测定发酵液中武夷菌素含量的方法。色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB-AQ(4.6mm × 250mm i.d. 5µm),柱温25℃；流动相为1.4g/L的三氯乙酸水溶液，流速1ml/min；检测波长254nm。将色谱峰面积与武夷菌素浓度进行线性回归得到的方程为Y=0.272+0.345X,r=0.9997,表明在0.2mg/ml～1.6mg/ml浓度范围内线性关系良好，变异系数为0.43%～2.08%，回收率为96.59%～100.57%。
关键词 高效液相色谱；武夷菌素；发酵液；三氯乙酸；测定
HPLC Determination of Wuyiensis in Fermentation Broth
WANG Li-dong1, 2, ZHANG Ke-cheng2﹡﹡, SHI Yi-ping2, TAN Wan-zhong1
(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute ofPlant Protection,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100094)2
(Southwest University, Plant Protection College, Chongqing, 400715)1
Abstract: A reverse phase high performance liquid chromatography method for the determination of Wuyiensis in fermentation broth was developed. Analytical conditions involved use of a SB-AQ column (4.6mm × 250mm i.d. 5µm) with temperature of 25℃. The mobile phase was 1.4g/L trichloroacetic acid，flow rate was 1ml/min and detection wavelength was 254nm．In linear range of 0.2mg/ml～1.6mg/ml, there was a regressive equation Y=0.272+0.345X, the correlation coefficient was 0.9997, the recovery rate was 96.59%～100.57% and the relative standard deviation was 0.43%～2.08%.
Keywords：HPLC;Wuyiensis; Fermentation Broth; trichloroacetic acid; determination
武夷菌素是从不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）发酵过程中产生的一种农用抗生素，可有效防治黄瓜白粉病、番茄灰霉病等多种作物真菌病害，其主要成分为具有胞苷骨架的核苷类抗生素[1]。目前武夷菌素的测定方法主要是生物测定方法[2]，但该方法测定所需的时间较长（24h-48h），而且测得的效价是样品内所含抗菌物质总的效价。为了准确、快速的测定发酵液中武夷菌素的含量,本文建立了利用反相高效液相色谱测定发酵液中武夷菌素含量的方法。
1实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilend 1100高效液相色谱仪（HPLC）,带可变波长紫外检测器；电子天平（AL104-IC Max 110g d=0.1mg,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；0.45μm微孔过滤膜；武夷菌素标准品（86%）及发酵液均由本实验室制备；三氯乙酸（分析纯），北京化学试剂公司；水（双蒸水）。
1.2色谱条件
色谱柱ZORBAX SB-AQ(4.6mm × 250mm i.d. 5µm)；流动相：三氯乙酸（1.4g/L）；流速：1ml/min;检测波长：254nm；进样量20μml，柱温25℃。
1.3标准品溶液的配制
准确称取武夷菌素标准品20mg(精确至0.2mg)，置于10ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，摇匀备用。
1.4 样品处理
武夷菌素发酵液先用滤纸过滤，再将滤液用孔径0.45µm的微孔过滤膜过滤后注射进样。
2 结果与讨论
2.1 分离条件的探索
首先将配置好的武夷菌素标准品样品,在200～400nm吸收波长范围内用紫外扫描仪扫描，发现最大吸收在254nm处。在流动相的选择上本实验采用了酸和水混合溶液，因此选择了耐酸耐水的色谱柱,先后使用了三氟乙酸和三氯乙酸做流动相对发酵样品进行分离,发现当三氯乙酸在1.4g/L时（pH≈2.0），可达到满意的效果见图1与图2。
图1 武夷菌素标准品色谱图
图2武夷菌素发酵液色谱图
2.2 标准曲线的绘制
定量方法用外标法[3]，精确称取一定量的标准品，加入蒸馏水稀释，配制成浓度为1.6mg/ml、1.2mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml 的标准品溶液。经0.45µm的微孔过滤膜后，进样20µl,每个浓度进样3次。将色谱峰峰面积(y)与武夷菌素浓度(x)进行线性回归，得出回归方程为Y=0.272+0.345X,r=0.9997,结果表明在0.2mg/ml～1.6mg/ml浓度范围内线性关系良好。
图2 武夷菌素标准曲线
Fig. Regression curve of Wuyiensis
2.3 精密度试验
取0.2mg/ml、0.4mg/ml和1.2mg/ml标准品溶液和某批次的发酵液做精密度实验，每个浓度重复5次，进样量20µl，测定出峰面积，求出变异系数分别为2.08％、1.56％和0.43％、1.73％
2.4 回收率试验
取已知含量的发酵液5ml共3份，分别加入2mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml标准品溶液5ml，精确进量20µl ，每份进样3次，测其出峰面积，求出平均回收率分别为100.57％、98.05％、96.59％，变异系数分别为1.88％、1.24％、3.51％。
3结论
本文采用不同极性的流动相对武夷菌素发酵液进行了分离，发现当极性增加时，武夷菌素各个组分的保留时间相应的增加，可以使其主要成分完全分离，因此选择了酸和水的混合溶液做为流动相，考虑到pH对色谱柱的影响和纯水流动相引起色谱柱塌陷的问题，因此选择了耐酸(1<pH<12)和耐纯水的色谱柱。武夷菌素不同浓度的标准品和各个批次的发酵液的保留时间存在着一定差异，这是由于pH的变化引起的，但不影响武夷菌素含量准确的测定。
本方法操作简单、快速，适用于发酵液中武夷菌素含量的检测。同时通过检测发酵液中各个组分的变化，为筛选武夷菌素高产菌株和改进发酵工艺提供了帮助。
参考文献
[1] 韦日清，林德忻，陈志和.微生物学报，1984,24（4）：401-402.
[3] 周启，王道本.农用抗生素和微生物杀虫剂.北京：中国农业出版社，1990. 83-86
[2]汪正范.色谱定性与定量.北京：化学工业出版社，2000.169-170
