先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种 的一些c-jun mRNA序列。
文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件 分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：
1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）
（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列
注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。
3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。
4. 结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。
如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析分析到底引物好不好。
实例
1、进入网页：http://www.NCBI .nlm.nih.gov/BLAST/
2、点击Search for short, nearly exact matches
3、 在search栏中输入引物系列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
(1)输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物 空格 输入下游引物
B、输入上游引物 回车 输入下游引物
4、 在options for advanced blasting中：
selec from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字改为10
5、在format中：
selec from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】
Expect后面的数字填上0 10
6、 点击网页中最下面的“BLAST!”
7、 出现新的网页，点击Format!
8、 等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。
(1)图形格式：
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配
通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。
(2)结果信息概要：
从左到右分别为：
A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息
B、系列的简单描述
C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基×2+0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。
D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了
E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：
U代表：Unigene数据库
E代表：GEO profiles数据库
G代表：Gene数据库
(3)结果详细信息：
①圈出来的部分代表序列的信息
②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：
共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2+0.1=42.1】，E值为0.020
上游引物与序列的2143～2163位点匹配
③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：
共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2+0.1=40.1】，E值为0.077。
下游引物与该序列的29360～29379位点互补
注意点：
①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。
②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?
A、 为同一个基因来源的不同的mRNA片段
B、 为该基因的DNA系列
C、 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。
结果判断：
①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用
②检测该引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反应的非特异扩增。如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分数非常高。这种结果表明所设计的引物序列特异性不高，最好重新设计引物，否则会得到非特异扩增的PCR产物。
