杨桂连 秦守涛 刘琼 王春凤*
(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)
摘 要：目的：构建连接乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重组质粒。方法：以瑞士乳杆菌基因组DNA为模板，克隆胞外蛋白水解酶基因，连接到以thyA 为选择压力的非抗性穿梭表达载体pW425et上，构建重组质粒pW425et-R，转化入thyA 基因缺陷型E.coli X13 感受态细胞，SDS-PAGE 电泳检测显示该水解酶得到了表达。结果：成功构建了重组质粒pW425et-R，胞外蛋白水解酶基因在E.coli X13 中得到正确表达。结论：成功地表达了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因，可为进一步制备具降血压功能基因工程乳酸菌提供参考。
关键词：乳酸菌；胞外蛋白水解酶；降血压肽；克隆；表达
Cloning of Extracellular Protease Gene from Lactobacillus and expression in Escherichia coli
YANG Gui-lian，QIN Shou-tao，LIU Qiong，WANG Chun-feng*
(College of Animal Science and Technology,
Abstract ：Objective: To construct a recombinant plasmid carrying extracellular protease gene from Lactobacillus. Methods:The extracellular protease gene was cloned from genomic DNA ofL. helveticus and inserted into the expression vector pW425et.Then the recombination plasmid was transformed into the competence thyA gene-mutant E. coli X13. The expressed protein wasanalyzed by SDS-PAGE. Results: The recombinant shuttle plasmid pW425et-R was constructed successfully and the Lactobacillus extracellular proteinase gene was expressed in E. coli X13. Conclusion: Our research idea is feasible for the successful expression of Lactobacillus extracellular protease gene in E. coli X13, which will provide a basis for further preparation of recombinantLactobacillus with anti-hypertensive function.
Key words：Lactobacillus；extracellular protease；anti-hypertensive peptide；cloning；expression
高血压是一种慢性心脑血管疾病，可诱发冠心病、脑出血等心脑血管疾病，并引起患者心、脑、肾等器官损伤以及糖、脂质代谢紊乱，该病己成为人类健康的第一杀手。
目前，世界卫生组织(WHO)批准用于治疗高血压病的一线抗高血压药物在治疗时往往会出现疼痛、发烧、恶心等副作用。寻找天然、安全、食品来源的降压物质来治疗高血压引起广大学的关注。1970 年在南美蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中发现一种血管紧张素转换酶抑制(angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)[1-2]。之后众多学者对于ACEIP 的生理特征、作用机理、提取及合成方法等进行了广泛的研究。研究表明，除从天然物质中分离提取以外，还可以利用蛋白酶水解食品蛋白获得。Oshima 等[3]首次通过蛋白酶水解食品蛋白中获得ACEIP。随后在几乎所有的食品蛋白的单一蛋白酶或多种蛋白酶联合水解物中获得多种ACE 抑制肽[4-8]，但该方法具有条件苛刻、设备要求精良、产量低以及副反应多等缺点，因此难以推广生产。目前除了蛋白酶水解法以外，微生物发酵法(特别是乳酸菌发酵法)成为获得ACEIP 的常用方法，并显示出良好的开发潜力及应用前景。
乳酸菌的降血压作用在于其代谢产生的蛋白酶可以降解牛乳蛋白而产生ACEIP。Yamamoto 等[9]用瑞士乳杆菌(L. helveticus)CP790 所分泌的胞外蛋白水解酶水解牛乳酪蛋白，发现其水解物有较强的抗高血压功能，并从中分离出降血压活性肽。2004 年Ueno 等[10]从L. helveticus CM4 中分离出一种分子质量约67kD 的酶，这种酶能够特异水解多肽释放出具有降血压活性的小肽Val-Pro-Pro 和Ile-Pro-Pro。进一步研究表明发酵乳制品降血压作用的强、弱与发酵用乳酸菌的种类密切相关，其中以瑞士乳杆菌的蛋白水解能力最强，且其发酵的牛乳具有较强的抗高血压活性[11-13]。
本研究设计特异性引物，以分离纯化的蛋白水解能力较强的L. helveticus NL05 的DNA 为模板，进行胞外蛋白水解酶基因的克隆。接着连接到以胸苷酸合成酶(thyA)基因为选择压力的穿梭表达载体pW425et 上，构建可在乳酸菌和大肠杆菌穿梭表达的重组质粒pW425et-R；继而转化入thyA 基因缺陷型E. coli X13 感受态细胞，通过生长功能弥补实验筛选阳性重组体并进行SDS-PAGE检测，以期为进一步制备具降血压功能重组基因功能乳酸菌提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌株和载体
瑞士乳杆菌(L. helveticus NL05)、E.coli X13 由吉林农业大学动物科学技术学院动物微生态学研究室保存；以thyA 基因为选择压力的载体pW425et 由本研究室构建并保存[14]；pMD18-T-simple 载体购自Takara 生物公司。
1.2 试剂
T4 DNA Ligase Promega公司；SacⅠ、KpnⅠ、ExTaq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶、DNAMarker Takara公司；DNA 凝胶回收试剂盒 Axygen公司；胸苷酸 美国 Sigma公司；其他常用试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器与设备
3-18K 型台式高速冷冻离心机 美国 Sigma公司；Tgradient PCR 仪 Whatman Biometra公司；DYCP
1.4 方法
根据GenBank 登录的L. helveticus 胞外蛋白水解酶基因序列(AB026985.1)设计特异性PCR 引物：P1：5＇-GCGGAGCTCATGAAGAAAAAT-3 ＇；P2：5 ＇-CGCGGACCTTAGTCAAAGTT-3 ＇(斜体下划线部分分别为Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切位点)，引物由大连TaKaRa 公司合成。提取L.helveticus NL05 DNA[15]，以提取DNA 为模板，以P 1、P 2 为上下游引物，对胞外蛋白水解酶基因进行PCR 扩增。反应体系如下：10 × Ex Taq Buffer 5.0μL；dNTP(2.5mmol /L) 4.0μL；上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL；Ex Taq (5U/μL) 0.4 μL；加双蒸水至50.0μL。反应条件为：
对pMD18-T-simple-R 和pW425et 均以SacⅠ、KpnⅠ双酶切。切胶回收纯化后以T4 DNA连接酶连接。连接产物应用CaCl2 转化法转化至thyA 基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coliX13 中，之后将转化产物在LB 固体培养基(不添加胸腺嘧啶核苷)上培养，筛选阳性重组体。
将筛选获得的含有pW425et-R重组质粒的阳性菌株接种在LB液体培养基(不含胸腺嘧啶核苷)中，
将各个时间诱导收获的菌液菌培养至OD 600nm为0.7。取菌液1.5mL，
2 结果与分析
2.1 乳酸菌胞外蛋白水解酶基因扩增与序列测定
以提取的L.helveticus NL05 DNA 为模板，PCR 扩增胞外蛋白水解酶基因。0.8% 琼脂糖凝胶电泳如图1 所示，在1350bp 附近有一条单一的扩增带，与预期大小相符。PCR 产物经纯化试剂盒纯化后与载体pMD18-Tsimpl e 连接、转化，最后进行质粒小量提取。经电泳选取其中滞后的质粒进行Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。
2.2 序列分析
将鉴定后的重组E.coli 菌送大连Takara 公司进行序列测定。测序结果经NCBI 在线BIAST 分析发现该序列与GenBank 中登录的L.helveticus CP790 胞外水解酶基因(AB026985.1)相似性为99.8%。
2.3 原核表达载体的构建与鉴定
分别对重组质粒pMD18-T-simple-R 和载体pW425et进行Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切，回收纯化后，以T4 DNA ligase 连接，随后转化至E.coli X13 中，筛选后小量制备质粒。将重组阳性质粒用Sac Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切后，电泳如图3 所示，得到了约4800bp 的pW425et 线性片段和1350bp 的插入片段，表明已成功构建含乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的原核表达重组质粒pW425et-R。
2.4 SDS-PAG分析
SDS-PAGE 结果显示在大约49.5kD左右可见明显的蛋白表达，空载体未出现，如图4 所示。分析上述经过鉴定为阳性的菌株在各时间的表达情况，可见在0～2h 蛋白表达量是随着时间延长而逐渐增加，2h 以后表达量基本稳定。
3 讨 论
Christiaens 等[17]研究发现乳酸杆菌可以作为基因工程菌表达外源基因，在信号肽的引导下，目的蛋白直接分泌进入上清，可以方便地获得目的蛋白。Fu 等[18 ]研究发现乳酸杆菌可以转化或表达保护性抗原基因或免疫调节因子，其作为受体菌表达内源性或外源性蛋白在功能食品、医疗保健等领域具有诱人的前景和无穷的潜力。1995年Nakamura等[19]发现原发性高血压大鼠长期服用酸奶Calpis 可抑制血压上升，并从中提纯、鉴定ACEIP，成为从乳酸菌发酵的牛乳中分离出ACEIP 的首例报道。这一发现将乳酸菌、乳蛋白和ACE 肽有机的结合在一起，为探索生产ACEIP 的新方法指明了方向。随着研究的不断深入，在乳酸菌发酵的牛乳中分离出大量的生物活性肽类物质，对其功能及生物特性研究表明具有良好的降血压作用。因此，微生物发酵法成为制备乳源ACEIP 研究方法。目前国内对乳酸菌和乳源降压肽的研究主要集中在乳酸菌菌种的筛选、发酵牛乳中降压肽的分离提纯及活性测定、发酵条件的优化等方面[20-22]。由于种属差异及乳酸菌本身蛋白酶分泌量有限，在发酵过程存在酶解效率低、副反应多、蛋白利用率低、回收纯化难度大等缺点，成为大量生产乳源ACEIP 的瓶颈。因此，利用基因工程技术改造乳酸菌，增加其胞外蛋白水解酶的表达量，增强自身水解能力，同时在发酵期间相对地提高乳酸菌水解牛乳蛋白的效率，产生更多的生物活性小肽来降低血压、降低胆固醇，成为新的探索方向。
本研究在已构建得以thyA 基因为选择压力的可在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的非抗性表达载体pW425et基础上，成功构建含有乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重组质粒pW425et-R，并转化入thyA 基因缺陷型E.coli X13 中，筛选获得阳性重组体，SDS-PAGE 电泳检测显示可以正确表达该水解酶。本实验中使用的thyA基因缺陷的E.coli X13 在普通的LB 培养基上不能生长，当转入含有thyA 基因重组质粒pW425et-R 后，可以在生长过程中表达胸苷酸合成酶，从而使t h y A 基因缺陷的E.coli X13 在普通的LB 平板上恢复生长，以便于筛选阳性重组体。同时在筛选过程中避免抗生素的介入，不仅解决了由于抗性基因漂移、扩散及整合，对环境、人和动物带来生物安全性的问题，同时也加大了改变水解性能的重组基因乳酸菌的安全性和实用性，为将来在乳酸菌中表达蛋白水解酶提供理论基础，为进一步探索改变或增强天然乳酸菌的发酵性能，增加乳源ACEIP的产量，生产“食品级”降血压食品、降血压药品及研究新型乳酸菌发酵制品提供参考。
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