解析干燥时间同样是影响冻干工艺样品的参数之一，因此在−26.5 ℃的温度下预冻4 h，−20 ℃进行升华干燥7 h，解析干燥温度暂定为30 ℃不变的条件下，选择以下4个时间进行试验，结果见表 5。在解析干燥阶段，随着解析干燥时间的延长，冻干效果显著，冻干周期也延长，能耗越来越高，至解析干燥4 h后，再延长时间，已基本无影响，因此确定解析干燥时间3.0、3.5、4.0 h作为Box-Behnken设计实验的水平。
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表 5 解析干燥时间对产品质量的影响 Table 5Effects of analytical drying time on product quality |
的考察，仅确定部分参数，其最佳工艺需进一步优选，本实验选取升华干燥温度（A）、升华时间（B）、解析干燥温度（C）、解析干燥时间（D）为考察因素，以冻干率为评价指标，采用Box-Behnken响应面法对工艺进行优化，考察各因素对产品质量的综合影响，试验设计及结果见表 6。方差分析见表 7。
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表 6 地龙活性组分冻干工艺响应面优化试验设计及结果 Table 6Design and experimental results of process of freeze-dried optimization of active components in lumbricus |
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表 7 方差分析 Table 7ANOVA regression analysis |
采用Design Expert 8.05软件，分别对各因素水平进行多元线性回归和非线性回归（二项式拟合），建立地龙活性组分冻干率（Y）对4个因素（A、B、C、D）的2次回归模型方程为Y＝96.62－0.52 A＋0.32 B－0.16 C＋1.58 D－0.002 5 AB－1.15 AC－0.005 AD＋0.005 BC－0.017 BD－0.002 5 CD－1.67 A2－0.48 B2－1.29 C2－3.21 D2。
经方差分析（表 7）得知，自变量1次项B，2次项B2显著（P＜0.05），1次项A、D，2次项AC、A2、C2、D2极显著（P＜0.01），表明模型具有统计学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度，本例P值为0.100 2＞0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在。进一步，校正决定系数（0.978 8＞0.80）和变异系数为0.46%，说明该模型只有2.12%的变异，表明该模型拟合优度较好，可用该模型及回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析和预测（预测结果见表 6）。
2.4.3 反应条件的优化及模型验证各因素之间的响应面图和等高线图见图 2，由Design Expert 8.05软件分析得响应面值最大时，A、B、C、D对应的编码值分别为0、0、0、0，与之对应的地龙活性组分最佳冻干工艺条件为升华干燥温度−20 ℃、升华时间7 h、解析干燥温度30 ℃、解析干燥时间3.5 h，此时冻干率的理论值达96.62%。
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图 2 Y与4因素的三维效应面图和等高线图Fig.2 3D Response surface plots and contour plots of Yand four factors |
为检验单因素及响应面预测的可靠性，选择最佳冻干工艺条件（预冻温度−26.5 ℃，预冻4 h，升华干燥温度−20 ℃、升华时间7 h、解析干燥温度30 ℃、解析干燥时间3.5 h）进行3批放大工艺验证试验，测定冻干率，并为确认本工艺不影响地龙氨基酸组分的活性，将验证批样品与对照药材的氨基酸指纹图谱进行相似性分析，判断是否最大程度保留其活性组分的有效性[2, 3]。
结果3批样品的冻干率分别为96.59%、96.45%、96.61%，指纹图谱相似度分别为0.912、0.905、0.915。采用最佳冻干工艺条件得到的地龙提取物颜色均匀，性状良好，测得冻干率在96.55%，与预测值96.62%基本吻合，说明响应面法优化的冻干工艺条件稳定，与对照药材的氨基酸指纹图谱相似度均大于0.9，表明该工艺具备可行性。
3 讨论动物药活性成分以多肽和蛋白质为主，地龙中含量最为丰富的物质即为蛋白质，但其主要成分氨基酸类具有水溶性和对热不稳定的性质，因此对提取后活性成分处理和保存是非常关键的。本实验采用冷冻干燥技术，应用单因素及Box-Behnken响应面设计方法，对其活性组分冻干工艺进行优化。结果表明，此优化方法在保证获得较好冻干率的基础上，能够最大程度地保留地龙提取物有效成分的活性，工艺稳定可行，为地龙制剂研究及临床应用提供一定的实验基础。
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