摘要：链霉菌是革兰氏阳性丝状细菌,其次级代谢产物具有抗感染、抗虫、抗肿瘤、免疫调节等生理活性,在医药、食品和农业领域具有重要应用价值。链霉菌的遗传操作技术是发现和改良新次级代谢产物的基础,近年来合成生物学的兴起为链霉菌的研发提供了全新的视角。综述了合成生物学在链霉菌次级产物生物合成基因簇克隆与组装、底盘细胞设计与改造、调节两者适配性方面的应用进展。
关键词： 合成生物学 链霉菌 次级代谢产物 生物合成基因簇 克隆与组装 最小化基因组 底盘细胞
Application of Synthetic Biology in Research and Development of the Secondary metabolites from Streptomyces
LI Xiao-mei, LIN Chun-yan, PANG Ai-ping, LI Xiao-bo, ZHAO Guang-rongCorresponding author grzhao@tju.edu.cn
Abstract:Streptomyces, a kind of Gram-positive bacteria, can produce lots of secondary metabolites which are widely used in the pharmaceutical industry, food processing and agriculture production. Genetic manipulation for Streptomyces is the foundation for the discovery and development of new secondary metabolites. The emergence of synthetic biology opens a new window for researches in Streptomyces and achievements on cloning and assembly of the biosynthetic gene cluster, the chassis cell design and the fitness were reviewed.
Key words: Synthetic biology Streptomyces Secondary metabolites Biosynthetic gene cluster Cloning and assembly Minimized genome Chassis cell
链霉菌是革兰氏阳性放线菌，能产生大量具有重要价值的次级代谢产物，包括抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制药物、抗虫药物等，广泛用于医疗、农业、食品等领域。随着对链霉菌持续的开发利用，特别是20世纪60年代以后，发现新型、高活性的次级代谢产物难度逐渐增大，主要原因在于：以传统方法克隆、改造次级代谢生物合成基因簇周期长且成功率低；新的链霉菌分离筛选工作没有突破性进展；研究透彻的链霉菌内源代谢途径多而复杂，不利于外源目标产物生物合成。本世纪兴起的合成生物学为链霉菌的定向设计与高效代谢产物合成研究提供了契机，为当前面临的研究难题提出了新的解决方案[1]。合成生物学是在系统生物学的基础上，引入系统设计理论构建具有预期功能的模块，在适当的“底盘”细胞中表达从而实现生物学功能[2]。合成生物学应用到链霉菌的研究中，在克隆、编辑与组装次级代谢产物生物合成基因簇、设计与改造链霉菌底盘细胞、提高两者适配性等方面取得重要进展。
1 次级代谢产物生物合成基因簇的克隆与组装
链霉菌的次级代谢产物结构是由其生物合成基因簇所决定的，克隆生物合成基因簇是改造产物结构和提高产量的基础。然而次级代谢产物生物合成基因簇往往较大(一般大于30 kb)，利用常规分子克隆策略，需要构建和筛选基因组文库，操作复杂且难以得到全长的基因簇。近年来研发的red/ET重组技术和酿酒酵母细胞内同源重组组装技术，是克隆和组装次级代谢产物生物合成基因簇中简单、高效的方法。
1.1 Red/ET重组技术克隆生物合成基因簇
Red/ET重组系统是基于λ噬菌体中redα、redβ、redγ基因和Rac原噬菌体中recE、recT基因建立的。λRed和RecET均能介导含有同源臂的线性DNA片段和环状DNA之间的同源重组 (linear plus circular homologous recombination,LCHR)。RecET还能高效催化线性DNA片段之间的同源重组反应(linear plus linear homologous recombination,LLHR)。2012年Fu等[3]把这些基因构建成不同类型的表达载体，通过控制同源重组蛋白的表达，从大片段文库中精准克隆出目标片段。将阿拉伯糖启动子控制的redα、redβ、redγ基因整合到大肠杆菌基因组上，得到GB05-Red菌株，用鼠李糖控制recE、recT、redγ、recA表达，构建出能够实现LLHR和LCHR两步重组的系统。片段化链霉菌基因组后，与载体片段共转化大肠杆菌，用鼠李糖诱导表达RecET系统，实现线性载体和目标片段的LLHR。将与目标片段一侧具有同源臂的筛选基因M2转化到大肠杆菌，用L-阿拉伯糖诱导表达red系统，实现目标片段和载体的LCHR，消除假阳性，得到准确目的片段，如图 1所示。
图 1 Red/ET重组技术克隆次级代谢产物生物合成基因簇
(a) 线性载体含有筛选基因M1 (b) 鼠李糖诱导RecET表达，目标片段与线性载体重组，线性载体自连产生假阳性 (c) L-阿拉伯糖诱导Red表达，筛选基因M2与目标基因片段同源重组，经过抗性筛选，消除线性载体自连的假阳性克隆
Fig. 1 Cloning of the secondary metabolite biosynthetic gene cluster via Red/ET recombination strategy
(a) DNA fragment of interest M1:Selectable marker 1 (b) Rhamnose induces the expression of RecET in GB05-Red +pSC101-PrhaRS-ETgA-tet,and a pool of constructed plasmid and background with recircularization plasmids is achieved (c) Arabinose induces the expression of Red in GB05-Red and a plasmid with M2 is achieved M2： Selectable marker 2
图选项
Fu等[3]将含有聚酮和非核糖体多肽类生物合成途径的基因片段与含对应同源臂的线性载体(氨苄青霉素抗性)导入GB05-Red重组系统中，直接从发光杆菌(Photorhabdus luminescens)基因组中克隆出7个未知结构的天然产物生物合成基因簇。2014年Su等[4]用此方法，在大肠杆菌中组装了48.4 kb的福司曲星(fostriecin)生物合成基因簇。Red/ET方法可望用于从链霉菌中克隆次级代谢产物生物合成基因簇。
Red/ET重组系统用于克隆次级代谢产物生物合成基因簇，效率高，操作简单，特异性强。此方法不受酶切位点的限制，只需要较短的同源臂，一般50~70bp就可以直接准确地从片段化的基因组文库中克隆出目标片段。
1.2 酿酒酵母细胞内同源重组组装
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，只要DNA片段两端有短的同源接头，酿酒酵母细胞就能把它们组装起来。基于酿酒酵母的高效组装能力，2009年Shao等[5]开发出DNA组装子(DNA assembler)技术，可用于组装生物合成基因簇。此方法仅需要设计和制备辅助载体片段和生物合成基因簇组装片段，并将其电转到酿酒酵母中，就能实现基因片段的组装。辅助载体片段包括：在酿酒酵母中稳定存在的片段、在大肠杆菌稳定复制的片段、在链霉菌中正常表达的片段。生物合成基因簇片段包括含有同源臂的、能覆盖整个生物合成基因簇的多个小片段。将这些片段转入酿酒酵母中实现一步组装，大肠杆菌中复制后，导入目的链霉菌中进行表达，如图 2所示。
图 2 酿酒酵母细胞内一步组装次级代谢产物生物合成基因簇
1： 酿酒酵母辅助片段包括自主复制序列、着丝粒序列和选择标记基因；2： 大肠杆菌辅助片段包括复制子和选择标记基因；3：链霉菌辅助片段包括复制子、接合转移元件、选择标记基因； 4：含有同源臂的目标片段，涵盖整个次级代谢产物生物合成基因簇
Fig. 2 One-step Assembler of the secondary metabolite biosynthetic gene cluster in S. cerevisiae
1: S. cerevisiae help fragment includes ARS,Ura,CEN; 2: E. coli help fragment includes ori,selectable marker1; 3: The target heterologous expression host help fragment includes ori,oriT,int,Marker2; 4: Pathway fragments with homologous arm; Gene elements from left to right
图选项
将金链菌素(aureothin)生物合成基因簇(长29.1 kb)等分为7个4~5kb的片段，片段之间具有400~600bp同源臂，基因簇片段与辅助片段之间具有40bp同源臂，辅助片段之间具有80bp的同源臂。2011年Shao等[6]用此方法组装了金链菌素的生物合成基因簇，并在变铅青链霉菌中成功异源表达。
通过此方法对组装片段进行理性设计，可突变、删减、优化原始基因簇，从而鉴定基因功能和发现新化合物。Shao等[5, 6]通过设计突变引物，在组装金链菌素合成基因簇过程中定点突变DH域，获得新化合物。在组装壮观链霉素生物合成基因簇时，分别缺失spnM、spnL+spnM、突变spnK，构建突变基因簇，在阿维链霉菌中均能合成壮观霉素，表明壮观霉素生物合成基因簇中的spnM、spnL、spnM这3个基因不是合成壮观链菌素的必需基因。针对灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中功能未知的沉默基因簇，2013年Luo等[7]采用DNA组装技术，使用6个高活性启动子，组装出含有特定启动子的基因簇，将其整合到变铅青链霉菌基因组上，激活基因簇的表达，发现了5种新型聚酮化合物。在组装过程中，通过缺失不同的基因，逐步确定了关键化合物的生物合成途径。2014年Yamanaka等[8]基于组装子技术原理，用3个辅助片段，构建了基因簇捕获载体。将此载体与一种海洋链霉菌基因组片段导入酵母细胞，进行同源重组筛选，获得了67kb非核糖体多肽抗生素taromycin基因簇，并在天蓝色链霉菌中成功表达。
酵母细胞内同源重组组装方法，操作简单，所需片段可用PCR制备，组装效率高。能实现“即插即用”，在酵母中组装后，可在其他底盘细胞中表达。酵母同源重组组装是目前最快、最经济的组装技术，在次级代谢产物生物合成基因簇的设计和改造中具有广阔的应用前景。
2 底盘细胞的设计与改造
链霉菌基因组中，除了主要抗生素产物的生物合成基因簇外，还有大量的其他次级代谢产物基因簇。在常规情况下，有些基因簇不表达，不能合成相应的产物，因此这些基因簇是非必需的。同时链霉菌基因组中还有大量的移动元件，是基因组不稳定的重要因素。敲除这些冗余基因簇和移动元件，可获得具有工业价值的最小化基因组(minimized genome)如图 3所示。最小化基因组的链霉菌遗传稳定，能高效表达目标产物，副产物少、分离纯化过程简单，可简化发酵工艺过程，是理想的底盘细胞。在基因组测序和实验数据的基础上，目前研究人员已构建出最小化基因组的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌。
图 3 最小化基因组
Fig. 3 Minimized genome
图选项
2.1 最小化基因组的阿维链霉菌
阿维链霉菌(Streptomyces avermitiles)是发酵生产阿维菌素的工业微生物，基因组为9.03Mb。2010年Komatsu等[9]通过比对阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌的基因组发现，这些微生物都有一个大小为6.28~6.50Mb的保守核心区域，确认为必需基因。采用同源重组和位点特异性重组技术，敲除类胡萝卜素等5种次级代谢基因簇、大部分转座子和11个插入序列，获得17个系列最小化基因组的阿维链霉菌。其中菌株SUKA17基因组最小，长7.3Mb。2013年Komatsu等[10]将核糖霉素、福里波霉素、抗霉素生物合成基因簇分别导入最小化基因组的阿维链霉菌中，抗生素产量均有提升，且未检测到内源产物。2014年Ikeda等[11]发现最小基因组化的阿维链霉菌中假定的转座酶基因减少了78%，类似插入序列(insertion sequence like)减少了67%。并在此阿维链霉菌中有效地表达了二十余种不同的外源基因，表明最小化基因组的阿维链霉菌的稳定性和高产性。
2.2 最小化基因组的天蓝色链霉菌
天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)是链霉菌研究的模式菌株，基因组为8.7Mb，广泛用于形态分化、孢子形成、抗生素生成及其调控的研究。2011年Gomez-Escribano等[12]依次敲除act、red、cpk和cda生物合成基因簇，得到敲除菌株M1146，其基因组比原始菌株减少173 kb。进一步定点突变rpoB(编码RNA聚合酶β亚基)和rpsL(编码核糖体蛋白S12)，获得M1154菌株，降低了代谢产物的复杂度。在M1154中，分别导入放线紫红素生物合成基因簇、氯霉素生物合成基因簇，产量均高于原始菌株。
2012年中国科学院上海生理与生态所Zhou等[13]敲除天蓝色链霉菌基因组中的10个聚酮生物合成基因簇、非核糖体多肽生物合成基因簇、线型染色体左臂的亚端粒区等1.2 Mb，构建出ZM11菌株。在ZM11中导入放线紫红素生物合成基因簇，与野生型比较，放线紫红素的产量有较大幅度的提高，表明ZM11能更好地表达目标产物生物合成基因簇。
3 提高异源生物合成基因簇与底盘的适配性
为了提高链霉菌中异源代谢产物的产量，常常采用抑制或敲除内源次级代谢产物生物合成基因簇。但是，异源基因簇与底盘细胞不适配的问题更突出，往往不能合成预期的产物或产量很低。因此需要调整关键基因的表达量、增加前体供应和纠错表达(图 4)。
图 4 提高异源生物合成基因簇与底盘细胞之间适配性
Fig. 4 Approaches to improve the fitness of the desired cluster and the chassis cell
图选项
3.1 调控关键基因的表达
在异源链霉菌中目标产物产量很低甚至无法合成，主要原因是基因簇未正常转录。直接过表达关键基因、更换活性适当的启动子，可精细调控关键基因转录量使基因簇正常表达。2013年Komatsu等[10]将春日霉素(kasugamycin)生物合成基因簇导入阿维链霉菌中，产量较低。转录检测发现调控春日霉素生物合成的基因kasT表达低效，通过多拷贝质粒提高kasT的表达水平，使春日霉素产量提高到一倍以上。启动子受复杂的转录因子调控，其活性直接影响基因表达的强度，因此需要寻找与底盘细胞系统匹配的启动子。2010年Dange等[14]敲除了途径特异性调控基因，使用四环素诱导的特异性启动子，在天蓝色链霉菌M512中异源表达新生霉素(novobiocin)生物合成基因簇，产量提高3~4倍。将90kb的美立霉素(meridamycin)生物合成基因簇导入变铅青链霉菌中，未检测到产物。用红霉素抗性基因启动子取代基因簇中的关键基因原始启动子，不仅激活了整个基因簇，而且提高了美立霉素产量[15]。2013年Du等[16]使用hrdB启动子驱动谷氏菌素(gougerotin)生物合成基因簇，在天蓝色链霉菌M1146中表达，产量提高10倍以上。
目前对链霉菌的启动子研究已经从筛选天然启动子转变到有目的地设计和合成人工启动子。Wang等[17]对kasO天然启动子进行改造，删除转录因子结合位点，同时进行随机突变和筛选，获得了工程化启动子。Siegl等[18]在天然红霉素抗性基因启动子的基础上，构建了合成的启动子文库，能对基因簇进行精细调控，调控幅度达2%~319%。这些人工启动子是非常有用的，由于其可调控性和应答性，在次级代谢产物基因簇的异源表达中具有重要应用价值。
3.2 增加前体供应
次级代谢以初级代谢物为物质基础并需要初级代谢途径为其提供足够的能量。成功表达异源生物合成基因簇，需要优化初级代谢产物和次级代谢产物之间的关系，可引入供体基因增加前体。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是甲基供体，能提高含有甲基途径的次级代谢产物的产量。在天蓝色链霉菌M512中异源表达新生霉素生物合成基因簇，引入表达SAM合成酶基因(metK)后，新生霉素产量提高了一半以上[19]。将metK基因导入阿维链霉菌ATCC31267中，阿维菌素的产量提高2倍多。然而导入阿维链霉菌76-05中，阿维菌素的产量并未提高[20]。因此需要根据基因簇和底盘细胞的遗传特点，调节和优化适配性关系。
3.3 纠错表达
次级代谢产物异源合成过程中有时会错误利用底物，造成分流限制合成能力，导致产量降低。引入纠错因子，纠正错误表达可以提高目标产量。在聚酮和非核糖体多肽合成过程中，II型硫酯酶(Type II thioesterase,TEII)具有纠正功能，参与延伸底物的特异性选择，水解错误的中间产物，辅助终产物的释放，从而提高整个途径的合成效率。在异源表达中，共表达TEII基因，可有效提高次级代谢产物的产量[21]。
底盘细胞中的某些基因编码酶会对异源次级代谢产物进行错误修饰，导致产物失活。阻断错误修饰，可恢复产物活性。灭瘟素(Blasticidin S)生物合成基因簇在变铅青链霉菌中表达时，底盘细胞内源的脱氨酶使灭瘟素生成无活性产物。通过阻断变铅青链霉菌中的灭瘟素脱氨酶基因，纠正错误修饰，得到了有活性的灭瘟素[22]。
4 结论与展望
链霉菌是临床应用的抗生素药物的主要来源，利用合成生物学技术，通过编辑和改造基因组，有望获得适用于工业环境的通用底盘链霉菌。通过设计与组装次级代谢产物生物合成基因簇，不仅可以发现沉默基因簇编码的化合物[7]，结合组合生物合成，还可创新化合物的结构。也可将不可培养微生物中基因簇进行异源表达，扩大新化合物的自然来源。通过优化异源基因簇和底盘细胞的适配性，提高产量，为新药研发提供足量的药源。合成生物学正在快速发展中，基因组尺度密码子替换技术[23]、CRIPSP基因组编程技术[24]、染色体人工设计和全合成技术[25]、动态细胞网络调控技术[26]等有待应用在链霉菌中。这将进一步简化链霉菌的遗传操作，提高效率、缩短研究周期，使天然产物药物的开发进入一个新阶段。
参考文献
[1] Singh V. Recent advancements in synthetic biology: Current status and challenges. Gene, 2014, 535 (1): 1-11.
[2] 张春霆.合成生物学研究的进展.中国科学基金, 2009, 23 (2): 65-69. Zhang C T. Advances in synthetic biology. Bulletin of National Natural Science Foundation of China, 2009, 23 (2): 65-69.
[3] Fu J, Bian X Y, Hu S B, et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nature Biotechnology, 2012, 30 (5): 440-448.
[4] Su C, Zhao X Q, Wang H N, et al. Seamless stitching of biosynthetic gene cluster containing type I polyketide synthases using Red/ET mediated recombination for construction of stably co-existing plasmids. Gene, 2014, 554 (2): 233-240.
[5] Shao Z Y, Zhao H M. DNA assembler: a synthetic biology tool for characterizing and engineering natural product gene clusters. Methods in Enzymology, 2012, 517: 203-224.
[6] Shao Z Y, Luo Y Z, Zhao H M. Rapid characterization and engineering of natural product biosynthetic pathways via DNA assembler. Molecular BioSystems, 2011, 7 (4): 1056-1059.
[7] Luo Y, Huang H, Liang J, et al. Activation and characterization of a cryptic polycyclic tetramate macrolactam biosynthetic gene cluster. Nature Communications, 2013, 4 (2894): 1-15.
[8] Yamanaka K, Reynolds K A, Kersten R D, et al. Direct cloning and refactoring of a silent lipopeptide biosynthetic gene cluster yields the antibiotic taromycin A. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 2014, 111 (5): 1957-1962.
[9] Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107 (6): 2646-2651.
[10] Komatsu M, Komatsu K, Koiwai H, et al. Engineered Streptomyces avermitilis host for heterologous expression of biosynthetic gene cluster for secondary metabolites. American Chemical Society Synthetic Biology, 2013, 2 (7): 384-396.
[11] Ikeda H, Kazuo S Y, Omura S. Genome mining of the Streptomyces avermitilis genome and development of genome-minimized hosts for heterologous expression of biosynthetic gene clusters. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2014, 41 (2): 233-250.
[12] Gomez-Escribano J P, Bibb M J. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology, 2011, 4 (2): 207-215.
[13] Zhou M, Jing X Y, Xie P F, et al. Sequential deletion of all the polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase biosynthetic gene clusters and a 900kb subtelomeric sequence of the linear chromosome of Streptomyces coelicolor. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters, 2012, 333 (2): 169-179.
[14] Dange V, Westrich L, Smith M C, et al. Use of an inducible promoter for antibiotic production in a heterologous host. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87 (1): 261-269.
[15] Liu H B, Jiang H, Haltli Bradley, et al. Rapid cloning and heterologous expression of the meridamycin biosynthetic gene cluster using a versatile Escherichia coli-Streptomyces artificial chromosome vector, pSBAC. Journal of Natural Products, 2009, 72 (3): 389-395.
[16] Du D, Zhu Y, Wei J, et al. Improvement of gougerotin and nikkomycin production by engineering their biosynthetic gene clusters. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97 (14): 6383-6396.
[17] Wang W, Li X, Wang J, et al. An engineered strong promoter for streptomycetes. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79 (14): 4484-4492.
[18] Siegl T, Tokovenko B, Myronovskyi M, et al. Design, construction and characterisation of a synthetic promoter library for fine-tuned gene expression in actinomycetes. metabolic Engineering, 2013, 19: 98-106.
[19] Zhao X Q, Gust B, Heide L. S-adenosylmethionine (SAM) and antibiotic biosynthesis: effect of external addition of SAM and of overexpression of SAM biosynthesis genes on novobiocin production in Streptomyces. Archives of Microbiology, 2010, 192 (4): 289-297.
[20] Zhao X J, Wang Q X, Guo W Q, et al. Overexpression of metK shows different effects on avermectin production in various Streptomyces avermitilis strains. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29 (10): 1869-1875.
[21] Kotowska M, Pawlik K. Roles of type II thioesterases and their application for secondary metabolite yield improvement. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98 (18): 7735-7746.
[22] Li L, Wu J, Deng Z X, et al. Streptomyces lividans blasticidin S deaminase and its application in engineering a blasticidin S producing strain for ease of genetic manipulation. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79 (7): 2349-2357.
[23] Isaacs F J, Carr P A, Wang H H, et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement. Science, 2011, 333 (6040): 348-353.
[24] Mali P, Esvelt K M, Church G M. Cas 9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods, 2013, 10 (10): 957-963.
[25] Annaluru N, Muller H, Mitchell L A, et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science, 2014, 344 (6179): 55-58.
[26] Xu P, Li L, Zhang F, et al. Improving fatty acids production by engineering dynamic pathway regulation and metabolic control. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111 (31): 11299-11304.
