回答2：基因工程菌最重要的是
1、前期要里积累到一定的数量；
2、数量达到之后，要快速进行诱导；
3、升温之后，要保持一定的补料速率，控制乙酸的积累量，使DNA表达达到最大。
回答3：抑制本底表达至关重要！！！
因为是重组大肠，外源基因的表达对大肠杆菌的生长是有很大影响的，换句话说是有毒性的，只是毒性大小的问题，超过了承受范围结果可想而知，因此如何在添加诱导物前抑制本地表达非常重要！
解决方法：优化培养基，碳源的利用：葡萄糖>乳糖,故可以调整两者的比例实现本地表达的最小化.等到大肠长到具备抵抗力的成熟期就ok了,注意葡萄糖不要多否则后面的IPTG无法起到诱导的作用了!
讨论4：高密度发酵是不是都能实现？
问题：现在心中存在一个疑问：是不是大部分基因工程菌（大肠杆菌或者酵母），都能实现高密度发酵吗？？？？
或者上发酵罐的产量都能比摇瓶水平高吗？？？？？高多少才算正常呢？我听说一个说法：说一般发酵罐条件优化了，都会比摇瓶高50%以上，是真的吗？？？？
回答1：现阶段手上有一个菌种，真是尝试了各种各样的碳源，不同种类的氮源，它的酶活水平就是很稳定，在发酵罐上也调整了溶氧，控制pH，酶活最多只有20%的提高。真是很是郁闷，没有太好的思路
回答2：一般的讲，只要该微生物能高密度生长，则该基因工程菌就可以高密度发酵（除非构建的产物对细胞生长都毒害作用，这个情况很少，因为不会选择这种宿主菌）
至于大罐优化发酵的结果，一般都能提高产量或效价的，因为一般大罐的生长环境比摇瓶要好控制的多。但是结果区别很大，有的大罐发酵可以比摇瓶提高10倍，几十倍的。
回答3：细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。
重组Escherichia coli的高密度培养及其过程控制参数
由于Escherichia coli高密度培养能够提高单位体积的产量，利于下游的分离纯化。因此，Escherichia coli高密度培养是发酵生产追求的目标。目前，采用透析反应器培养E.coli K-12以及培养重组Escherichia coli生产PHB菌体浓度达到204.3g/L DCW。已发表的Escherichia coli最高菌浓为175.4g (DCW)/L。限制Escherichia coli高密度发酵主要是营养供给限制（包括溶氧供给不足），代谢副产物积累和发酵液流变学特性等因素的限制。
高密度培养过程需要控制参数： 溶氧
在微生物培养时，必须不断地向培养液提供足够的氧，以满足微生物生长代谢的需要。在实验室中，可以通过摇床的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的微生物供氧，而较大生产规模的培养装置则需采用无菌空气并同时进行搅拌的方式对微生物供氧，通风和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需的氧。由于微生物的新陈代谢与氧气呼吸有关，调节通气和搅拌可影响发酵周期时间的长短和代谢产物生成的高低，因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节控制的重要参数，在培养过程中有效而经济的供氧是极为重要的。
工艺上主要的控制溶氧手段有以下几种
1)改变通气速率(增大通风量)；
(2)改变搅拌速度；
(3)改变气体组成中的氧分压；
(4)改变罐 压；
(5)改变发酵液的理化性质；加入氧载体。
温度
由于微生物的生长和产物的合成代谢都是在各种酶的催化下进行的，而温度却是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。温度对发酵的影响是多方面的，对微生物细胞的生长和产物的生成、代谢的影响是由各种因素综合表现的结果。
pH值
发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是发酵过程中重要参数，对微生物的生长和产物的积累有很大的影响。对于同一种微生物，由于pH值的不同，形成的发酵产物也会不同。
发酵过程中pH值的变化情况
1)在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种不同，相对于接种后的起始pH值来说，发酵液的pH值有上升或下降的趋势；
(2)在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在最适合产物形成的pH范围；
(3)在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微生物趋于自溶，引起培养液中氨基酸等的增加，致使pH值上升。
引起发酵液的pH值下降的主要原因有
1)培养基中的碳/氮比不合适，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质的氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累；
(2)消泡油加得过多；
(3)微生物生理酸性物质的存在。引起发酵液pH值上升的主要原因有
1)培养基中的碳/氮比不当，氮源过多，氨基酸释放会使pH值上升；
(2)生理碱性物质的存在；
(3) 中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多。
重组Escherichia coli高密度培养及外源蛋白高表达研究
重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中，常常遇见的是高密度低表达现象，表达效率只有摇瓶的三分之一。实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。
高密度培养下提高外源基因表达的策略
(1)添加复合氮源
菌体生长至高密度时，营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段，限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度，对外源基因表达不利，补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，减轻了细胞代谢负担，促进了外源蛋白的表达。
(2)利用代谢工程方法消除乙酸的抑制作用
乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度，而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。pH为中性时乙酸以HAc 和Ac－形式共存，Hac渗透过细胞膜，在细胞内（pH约为7.5）再分解为H＋和Ac－。由于不断渗透使胞外HAc和Ac－之间平衡向Hac移动，结果引起一个净电中性H＋内流，降低了胞内pH 。由于具有缓冲功能的培养基体积大，乙酸渗透不会导致胞外pH发生剧烈变化，因此胞内pH降低将产生去偶联影响。细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势，即使质子推动力不发生变化情况下也是如此。因此为了快速生长，E.coli不仅需要一个大的质子电动势，而且需要维持最佳胞内
pH。乙酸大量积累将加剧代谢去偶联的发生。也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制，而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。
目前，一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究，比如培养基优化法，有人以甘油代替葡萄糖作为碳源，实现了高密度培养；葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。为了减少或避免乙酸积累，已经发展了各种葡萄糖流加策略，流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。利用代谢工程的方法改造菌种实现控制乙酸生成的手段也越来越被人们所重视。例如PTA和ACK代谢突变株的筛选。[/size]
(3)增强供氧能力
溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中受很多方面因素的限制，而DO往往是最易成为控制因素。这是氧在水中的溶解度很低所致。在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg/L，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中的DO可在几分钟之内便耗竭，使DO成为限制因素。在工业生产中产率是否受氧的限制，单凭通气量的大小是难于确定的。因为DO的高低不仅取决于供氧，通气搅拌等，还取决于需氧状况。故了解溶氧是否够的最简便又有效的办法是就地监测发酵液中的溶氧浓度。从DO变化情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。
生长过程中从培养液中的溶氧浓度的变化可以反映菌的生理生长状况。随菌种的活力和接种量以及培养基的不同，DO在培养初期开始明显下降的时间不同。一般在接种后1-5h内，这也取决于供氧状况。通常，在对数生长期DO明显下降，从其下降的速率可估计菌的大致生长情况。DO低谷到来的迟早与低谷时的DO水平随工艺和设备条件而异。二次生长时DO往往会从低谷处上升，到一定高度后又开始下降——这是利用第二种基质的表现。生长衰退或自溶时会出现DO逐渐上升的规律。值得注意的是，在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌，过高的DO对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成O，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-，或羟基自由基OH-，破坏许多细胞组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感，好气微生物曾发展一些机制，如形成触酶，过氧化物酶和超氧化歧化酶（SOD），使其免遭氧的摧毁。次级代谢产物为目标函数时，控制生长不使过量是必要的。
增加溶氧的方法有：
①在通气中掺入纯氧或富氧，使氧分压提高；
②提高罐压，这固然能增加溶氧，但同时也会增加溶解CO2的浓度，因为它在水中的溶解度比氧高30倍。这会影响pH和菌的生理代谢，还会增加对设备强度的要求；
③改变通气速率，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分；在通气量较小的情况下增加空气流量，DO提高的效果显著。但在流量较大的情况下再提高空气流速，对氧溶解度的提高不明显，反而会使泡沫大量增加，导致逃液。
④提高设备的供氧能力（以氧的体积传质（简称供氧）系数KLa表示），从改善搅拌考虑，更容易收效。改变搅拌器直径或转速可增加功率输出，从而提高a值。另外改变挡板的数目和位置，使剪切发生变化也能影响a值。在考查设备各项工程参数和工艺条件对菌的生长和产物形成的影响时，同时测定改条件下的DO参数对判断氧的供需是大有好处的。
(4)优化诱导条件及诱导方法
在重组Escherichia coli高密度培养过程中，要达到重组产物的最大比生产率，还要考虑合适的诱导时间、诱导剂强度、诱导时的温度、诱导的培养基以及营养物的流加策略。
