一、试验材料与方法
（一）材料
胶质芽孢杆菌JXF菌株由实验室从硅肥中分离筛选。供试矿物为纯度85%的石英（从郑州铝矿中分离得到），高岭石、钾长石（纯度为92%）。培养基：以阿什贝基质培养基为基础，配制含氮、无氮与含石英粉3种不同的培养基。
（二）分析内容及方法
3个500ml锥型瓶分别装150ml培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，120℃灭菌2h，冷却后将胶质芽孢杆菌菌悬浮液按2%接种量接入锥型瓶中，36℃振荡培养（200r/min），培养0、6、12、24、36、48、72、96h后分析。
有机酸的测定：采用硫酸提取法，用高效液相色谱测定各种发酵液中有机酸的含量。
氨基酸的测定：发酵液先用三氯醋酸法处理，用0.015mol/L盐酸稀释后用氨基酸分析仪测定。
3种培养基发酵液中的多糖测定：在提取有机酸后的发酵液中加入乙醇离心分离，60℃烘干，秤重，得到粗多糖。
（三）硅酸盐代谢产物浸溶钾长石的分析
利用各种胶质芽孢杆菌代谢产物，采用摇瓶浸出的方法浸出钾长石。采用硅钼蓝分光光度法测定浸出液中硅。
二、试验结果分析
（一）JXF菌种发酵液中的代谢产物
1、菌种发酵液中的有机酸 发酵液中有机酸含量的测定结果表明，无氮含石英粉培养基中有机酸含量最大。通过定性检测，发现不同时期的菌株发酵液中均检测到如下4种有机酸：草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸，定量检测结果见表1。由表1结果可以看出，细菌在发酵初期（6～48h），虽然细胞数量不是最多，但由于细菌代谢活性强，合成的有机酸较多。随细菌发酵时间的延长，尽管细胞数量大幅度的增加，但细菌合成的有机酸量却有较大程度的下降，这说明在细菌生长繁殖的过程中，由于发酵液中营养物质的不断消耗，细胞合成并分泌到发酵液中的有机酸又作为营养物质被细菌利用了。
表1 菌株发酵液中成分检测结果
|
培养时间/h
|
有机酸含量/（mg·L－1）
|
细胞数/（个·mg－1）
|
|||
|
草酸
|
酒石酸
|
柠檬酸
|
苹果酸
|
||
|
6
12
24
36
48
60
72
|
6.75
98.60
103.12
120.56
150.12
68.25
56.65
|
3.20
90.25
112.36
120.45
136.60
101.33
85.76
|
2.55
90.00
95.23
98.25
107.25
86.65
80.34
|
2.23
78.12
85.23
97.25
109.65
61.38
27.31
|
2.5×103
2.5×106
5.0×106
6.1×107
3.2×108
4.6×108
2.8×108
|
2、JXF-1菌株发酵液中氨基酸 试验发现，在3种不同的培养基中，JXF菌种产生各种氨基酸的量及种类基本相同，故试验只测定了含石英粉的无氮培养基中的氨基酸种类及其含量。通过定性及定量分析，发现硅酸盐细菌可以合成各种类型的氨基酸，能检测到的氨基酸主要有15种，结果见表2。由表2结果可以看出，在不同的发酵时期，菌种合成的氨基酸量有较大的差别，天冬酰胺、半光氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、缬氨酸等几种氨基酸主要在发酵前期合成，随着发酵时间的延长，发酵液中这几种氨基酸浓度逐渐下降，说明菌种又充分利用它们作为自身生长繁殖的营养物质。随着发酵时间的延长，发酵液中甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸、丝氨酸等几种氨基酸浓度逐渐增加，说明该细菌能不断的合成这几种氨基酸。同时，在不同的发酵阶段，细菌合成氨基酸的种类也不一样，甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。半光氨酸主要在细菌发酵前期合成，脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等几种氨基酸主要在发酵后期合成。在菌种发酵过程中，合成氨基酸含量最高的为丙氨酸，其次为甘氨酸，合成氨基酸量最少的为天冬氨酸。
表2 细菌合成的氨基酸种类和含量
|
氨基酸类型
|
氨基酸含量/（μg·L－1）
|
|||
|
24h
|
36h
|
48h
|
72h
|
|
|
甘氨酸
丙氨酸
缬氨酸
亮氨酸
异亮氨酸
脯氨酸
苯丙氨酸
酪氨酸
蛋氨酸
丝氨酸
精氨酸
天冬酰胺
天冬氨酸
半光氨酸
|
0.650
2.771
0.859
0.966
1.210
—
—
0.396
0.098
—
0.851
—
0.075
—
1.165
|
0.546
1.511
0.778
0.423
1.023
0.451
—
0.457
0.177
—
0.105
0.112
—
0.456
2.456
|
1.474
0.356
0.456
0.300
0.250
0.111
0.541
0.332
0.044
0.190
0.507
0.378
—
—
—
|
1.564
0.685
0.123
—
0.806
—
0.124
—
0.218
0.225
0.442
0.235
—
—
—
|
备注：“—”表示未检测出数据。
3、菌种发酵液中多糖 在JXF菌种分离、发酵培养及浸出硅酸盐矿物作用研究中发现，该菌种在有氮培养基、无氮培养基、无氮含石英扥硅酸盐矿物的培养基中产生的荚膜多糖含量存在较大的差别。因此，试验选择上述3种培养基，定性定量分析该菌种在各培养基中产生荚膜的动态变化，测定结果见图1。试验结果表明，JXF-1细菌可以合成葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、山梨醇、肌醇等数种糖醇类物质。在无氮石英培养基中，菌种生产荚膜多糖的能力最强，其次是在无氮培养基中。在有氮培养基中，该菌种产生的荚膜多糖最少，仅为3.76g/L，只有无氮铝土培养基中荚膜多糖的25%左右。同时，从图1可以看出，随着菌种发酵培养时间的延长，荚膜多糖的含量有较大的变化，在0～48h内，多糖产量随时间的延长而增加，发酵培养到48h时，菌种在3种不同培养基中荚膜多糖产率均达到最高；在48h以后，荚膜多糖的含量随菌种发酵时间的延长而降低，说明培养液中的荚膜多糖部分被细菌作为生长繁殖的营养物质而利用，使得菌液中的多糖含量减少。以上结果表明，JXF-1菌种在有效多氮源存在的情况下，形成荚膜多糖的能力较低；而在较少氮源或无氮的情况下，该菌种能较多的合成荚膜多糖；在无氮铝土矿培养基中，由于有大量的二氧化硅存在，使该菌种能大量的合成荚膜多糖。
图1 不同培养基对JXF-1菌种产生荚膜多糖的影响
（二）JXF细菌代谢产物对硅酸盐矿物的浸溶作用
硅酸盐细菌各种代谢产物对含钾矿物中的钾均有一定的溶解能力，但对其是否能活化其中的硅，目前选矿学者并未作过系统研究，大多都是一种推测。本文通过试验研究了JXF细菌代谢产物对硅酸盐矿物的浸溶作用。
1、有机酸对钾长石的溶解作用 按照硅酸盐细菌发酵液中检测到的4种有机酸的含量范围，分别配制最大浓度为200mg/L的草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸溶液，同时分别配制pH值为2.5的EDTA二钠和蒸馏水做对比。将10g钾长石粉分别加入100mL上述有机酸和EDTA溶液中，25℃振荡作用7d后，过滤，测定滤液中的铝、硅含量，结果见表3。由表3结果可以看出，酸性条件下有机酸溶解钾长石的效果优于中性条件下有机酸对钾长石的溶解，说明有机酸溶解硅酸盐矿物的作用既有酸溶作用，又包含有有机酸的配合作用，而且起主要作用的是有机酸的配合作用。同时从表3结果可以看出，由于EDTA具有很强的配合硅酸盐矿物中硅、铝等金属离子的作用，从而增加了这些离子的溶出作用，使EDTA溶液中的硅、铝量较含各有机酸的溶液要高出很多。但如果用25%的双氧水破坏上述有机酸的结构，结果发现它们溶解钾长石的能力大大降低，说明上述有机酸溶解钾长石并使其中的硅、铝等元素释放出来与其特有的结构有关，即与—COOH等具配合作用的基团含量密切相关。
表3 有机酸对钾长石的浸溶作用
|
有机酸名称
|
pH值
|
浸出上清液中元素含量/（mg·L－1）
|
|
|
SiO2
|
Al2O3
|
||
|
草酸
草酸
25%H2O2＋草酸
柠檬酸
柠檬酸
25%H2O2＋柠檬酸
酒石酸
酒石酸
25%H2O2＋酒石酸
苹果酸
苹果酸
25%H2O2＋苹果酸
EDTA二钠
蒸馏水
|
2.5
7.0
2.5
2.5
7.0
2.5
2.5
7.0
2.5
2.5
7.0
2.5
2.5
2.5
|
65.54
52.15
41.26
59.46
48.25
45.20
35.61
32.25
25.06
62.51
45.63
47.85
89.65
6.50
|
15.41
13.45
10.25
11.23
8.92
6.52
15.63
14.23
10.50
23.54
18.36
15.63
35.23
4.52
|
发酵液中检测出的4种有机酸分别在不同浓度下对钾长石的溶解试验结果见图2。作为对照，采用各种有机酸的相对含量比例分别配制25、50、100、150mg/L4种混合有机酸对钾长石进行浸出，浸出结果见图3。
图2 4种有机酸对钾长石的溶解
图3 混合有机酸对钾长石的溶解
从图2及图3中可以看出，各种有机酸对钾长石中硅的溶解作用分别为草酸＞混合有机酸（草酸＋柠檬酸＋苹果酸＋酒石酸）＞柠檬酸＞酒石酸＞苹果酸。酒石酸、苹果酸随浓度的变化，浸出液中硅的含量变化不大。
2、氨基酸对钾长石、高岭石的浸溶作用 在500mL的锥型瓶中加100mL蒸馏水和10g钾长石或高岭石和混合氨基酸（取试验测得的硅酸盐细菌发酵液中最大浓度的每种氨基酸混合组成），25℃振荡作用7d后，测定上清液中铝、硅的含量，结果见表4。从表4结果可以看出，氨基酸具有一定浸出硅酸盐矿物中铝、硅的能力，当混合氨基酸的结构在双氧水的作用下受到破坏时，其浸出能力大大降低。这说明氨基酸中—COOH、—NH2基团具有配合高岭石、钾长石中硅的能力。
表4 氨基酸对钾长石的溶解作用
|
处理方式
|
上清液中含量/（mg·L－1）
|
|
|
SiO2
|
Al2O3
|
|
|
高岭石＋混合氨基酸
高岭石＋混合氨基酸＋H2O2
高岭石＋蒸馏水
钾长石＋混合氨基酸
钾长石＋混合氨基酸＋H2O2
|
42.67
15.69
5.66
69.78
25.76
|
9.36
6.76
3.35
1.30
0.50
|
3、多糖对钾长石的浸溶作用 将一定量的多糖加入锥型瓶中，并分别配制成如表5的各种浓度，于25℃振荡作用7d后，测定溶液中的铝、硅含量，试验结果见表5。从表5数据可以看出，硅酸盐细菌发酵培养所产生的多糖对钾长石中的铝、硅有一定的浸出作用，随着多糖含量的增加，上清液中的铝、硅含量明显增加。用25%的双氧水降解多糖，由于其氧化作用，使多糖的有机结构受到破坏，因而浸出能力降低。这的因为多糖含有各种具配合作用的有机基团，与矿物中各种金属离子形成配合物，从而使溶液中铝、硅含量增加。
表5 硅酸盐细菌分泌的多糖对钾长石中的硅、铝的浸溶
|
处理方式
|
上清液中含量/（mg·L－1）
|
|
|
SiO2
|
Al2O3
|
|
|
钾长石＋蒸馏水
多糖＋蒸馏水
钾长石＋多糖（0.30%）
钾长石＋多糖（0.50%）
钾长石＋多糖（0.70%）
钾长石＋多糖（0.90%）
钾长石＋多糖（1.10%）
钾长石＋多糖（1.10%）＋H2O2
|
1.33
1.12
8.85
10.44
13.21
15.36
26.30
5.30
|
1.02
1.30
4.56
1.52
3.80
4.03
6.23
1.20
|
4、有机酸、氨基酸、多糖协同作用对钾长石的浸溶作用 在500mL的锥型瓶中各代谢物及供试矿物的组成——混合有机酸的组成：各取浓度为200mg/L的4种有机酸（草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸）；混合氨基酸的组成：其最大浓度的每种氨基酸混合组成；多糖浓度为8.5g/L；钾长石15g/L。
有机酸、氨基酸、多糖对硅酸盐矿物中硅、铝均有明显的浸出作用，试验结果见图4。由图4可以看出，各代谢产物分解钾长石的能力为：混合有机酸＞混合氨基酸＞多糖。氨基酸、有机酸、多糖三者混合物溶解钾长石的能力比单独代谢产物的溶解能力大大的增加。另外，细菌的代谢产物浸出钾长石中硅、铝能力与其结构有关，用双氧水破坏代谢物的结构，它们活化钾长石的能力大大降低。同时，硅酸盐细菌的代谢产物对钾长石的活化主要是通过具有配合基团的有机物的配合作用，各代谢产物均具有与矿物中各种金属特别是铝、硅等形成配合的有机基团如—COOH、—NH2或—COO－、—NH4＋，它们均对金属离子具有一定的配合能力。
图4 不同代谢产物对钾长石的溶解作用
1-荚膜多糖；2-混合氨基酸＋荚膜多糖；3-混合有机酸；
4-混合有机酸＋多糖；5-混合有机酸＋混合氨基酸；
6-混合氨基酸＋混合有机酸＋荚膜多糖
不同物质对钾长石处理后的扫描电镜照片见图5。从图5可以看出，JXF菌种的代谢产物破坏钾长石品格结构的能力大于0.01mol的硝酸对钾长石晶格结构的破坏，而用H2O2作用于菌种的各种代谢产物后，其破坏钾长石晶格结构的能力下降。
图5 不同物质对钾长石处理后的扫描电镜
（a）有机酸＋氨基酸＋荚膜多糖；（b）有机酸＋氨基酸＋荚膜多糖＋H2O2；
（c）0.01molHNO3；（d）钾长石原矿样；（e）蒸馏水
三、结语
（一）验证了硅酸盐细菌在普通阿什贝基质液体培养基中可以代谢产生4种有机酸、多种氨基酸和胞外多糖。尽管在不同的培养基中JXF菌种产生的氨基酸种类和数量没有明显差别，但其代谢产生的有机酸和胞外多糖的量存在较大的差别，这一研究结果目前还未见相关的文献报道。菌种产生的单一代谢产物对硅的浸出效果明显要低于多种代谢产物协同作用的效果。
（二）JXF菌株能合成并分泌草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等4种有机酸和多种氨基酸到发酵液中。随着发酵时间的延长，4种有机酸的含量逐渐降低，说明随着培养液中营养物质的逐步消耗，细菌开始利用自身分泌的有机酸作为繁殖生长的物质基础。
（三）JXF菌株在发酵过程中可以合成20种氨基酸中的15种，包括2种碱性氨基酸、2种酸性氨基酸以及带有羟基的2种氨基酸。其中甘氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、赖氨酸等几种氨基酸主要在发酵前期合成，不同发酵时期，菌种合成或又消耗自身合成氨基酸的种类各不相同。
（四）在含氮、无氮和含石英粉的3种不同的发酵培养基中，菌种合成多糖的能力存在较大的差异，在有氮培养基中，细菌产生的多糖最少，而在无氮石英培养基中，菌种产生多糖量最大。
（五）摇瓶浸出及电镜试验表明，有机酸、氨基酸、多糖均具有破坏钾长石晶格结构的能力而释放出其中的铝、硅，原因是这些有机物具有配合矿物中各种金属离子的有机基团，并有一定的酸溶作用。各种代谢产物在浸出硅酸盐矿物中具有协同作用，三者的混合物对钾长石晶格结构破坏最明显，其浸矿效果也明显优于它们各自对矿物的作用效果。
