1、 概述
自1944年 Waksman等报道了链霉菌产生的链霉素以来,已报道的天然和半合成氨基糖昔类抗生素的总数已超过3000种,其中微生物产生的天然氨基糖昔类抗生素有近200种。氨基糖苷类(aminoglycosides)抗生素是临床上重要的一类抗感染药物,具有水溶性好、化学性质稳定、抗菌谱广、抗菌能力强和吸收排泄良好等特点,虽然近年受到口内酰胺类和喹诺酮类抗感染药物的挑战,但仍是治疗G 菌和结核杆菌感染的首选药物一。对某些革兰阳性也有良好的杀菌作用。与青霉素类或头孢菌素类合用,常可取得协同作用。其杀菌活力在一定范围内为浓度依赖性,并具有明显的抗生素后效应(PaE) 。
根据氨基糖苷类抗生素的抗菌特性及结构特点,此类抗生素可分为三个发展阶段。以卡那霉素为代表的第一代氨基糖苷类抗生素,其结构特点是完全羟基化的氨基糖与氨基环醇相结合,不抗绿脓杆菌;第二代以庆大霉素为代表,其结构中均含有脱氧氨基糖并具有抗绿脓杆菌的特点;第三代则是氨基环醇上氮位取代衍生物,品种有阿米卡星、阿司米星和我国创新的一类新药依替米星等,其特点是保留了母体的抗菌活性,耳肾毒性小,抗耐药性等。根据氨基糖数目分为假三糖类和假二糖类,氨基含量越多,抗菌能力越强。(见表1)。
临床应用的主要品种可分为耐酶品种和不耐酶品种。
耐酶品种:细菌所产的乙酰转移酶、磷酸转移酶和核苷转移酶等氨基糖苷类钝化酶可破坏卡那霉素、妥布霉素等,而新品种对钝化酶较稳定,如阿米卡星、依替米星和异帕米星,均主要用于耐庆大霉素菌株。阿米卡星的抗菌谱与庆大霉素相似,其抗菌活性优于卡那霉素,稍次于庆大霉素。奈替米星的抗菌作用与庆大霉素相似;对各种氨基糖苷类钝化酶较稳定,稍次于阿米卡星;临床也用于较重的革兰阴性杆菌(主要为耐庆大霉素菌株)所致感染。依替米星其分子结构与奈替米星极相似,仅少一双链,故更稳定。对氨基糖苷类钝化酶的稳定性、抗菌作用及其临床疗效均与奈替米星相似。异帕米星的抗菌谱与阿米卡星相似,该品对氨基糖苷类钝化酶的稳定性优于阿米卡星;主要用于革兰阴性杆菌严重感染,特别是对其它品种包括对阿米卡星耐药菌株所致感染。总体上,耐酶品种以异帕米星为优,其它依次为阿米卡星、奈替米星和依替米星。
不耐酶品种:妥布霉素与西索米星(sisomicin)虽然对铜绿假单胞菌的作用优于庆大霉素,但对钝化酶不稳定,故仍用于庆大霉素敏感菌株感染,而不适用于庆大霉素耐药株所致感染。细菌对卡那霉素的耐药性明显,临床已少用,新霉素全身用药毒性明显。小诺霉素与核糖霉素作用弱,毒性稍低,仅用于革兰阴性杆菌轻症感染。
3 氨基糖苷类抗生素的质量分析
正是由于氨基糖苷类的结构和临床应用特点,为了科学合理、安全有效地使用这类抗生素,aGs 的定量和痕量分析受到了临床医学和药物分析工作者的重视,特别是对有关物质的分析更是近年来的热点。
由于氨基糖苷类抗生素绝大多数无特征的紫外吸收,因此微生物效价法是当前各国药典测定该类抗生素含量的主要方法。同时,微生物法检测成本相对低廉,适于推广使用。但微生物法测定的是总效价,不能分别测定主成分和相关组分或有关物质的量,不能准确反应氨基糖苷类抗生素的内在质量,且影响因素复杂,操作费时。随着对抗生素结构及其物理化学性质的进一步了解,对于含有抗菌活性的杂质或多组分的抗生素,辅以控制组分及杂质的方法,以弥补效价法测定含量专属性不强的缺点,达到监控药品质量的目的。现介绍目前已应用于氨基糖苷类抗生素质量控制的几种方法。
3.1 薄层色谱(TLC)法 薄层色谱法操作简单,耗时短,所需设备价廉,在氨基糖苷类抗生素的鉴别及有关物质检查中占有主要地位,《中国药典)2005年版收载的l2种氨基糖苷类抗生素中有8种采用薄层色谱鉴别方法。氨基糖苷类抗生素为极性较强的碱性化合物,在使用硅胶作薄层色谱的固定相时,展开剂中需要加入氨水调节ph值以减少拖尾现象。由于其结构中具有伯氨基,显色剂中多含有与伯氨基发生显色反应的茚三酮。
3.2 高效液相色谱(hPLC)法 由于氨基糖苷类抗生素没有特征的紫外吸收,采用通常的UV检测器检测较困难,故该类药物的hPLC法以衍生化与非衍生化法为主。
3.2.1 衍生化法 衍生化方法可分为柱前衍生和柱后衍生两种,采用的衍生化试剂有邻苯二醛(OPa)、2,4一二硝基氟苯(DNFB)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),异氰酸苯酯(PiC) ,3 ,5-二硝基苯甲酰氯(DNBCL) (以上用紫外检测器)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-CL) (用荧光检测器)等。利用氨基糖苷类抗生素结构中的活泼基团(如氨基、羰基)与衍生化试剂形成紫外区有吸收或有荧光的物质,以便于紫外检测或荧光检测。柱前衍生化方法较简单。不需要特殊的设备;柱后衍生化采用在线技术,便于自动化测定,但需要有特殊的衍生化反应装置,因此柱前衍生化方法较多被采用。由于衍生化法供试品制备步骤繁琐,色谱条件多选用含盐较多的流动相,必要时需加入离子对试剂,长期应用有损色谱柱及进样器的使用寿命;同时影响试验结果因素较多,重现性差。因此,非衍生化方法的开发则更具有实用价值。
3.2.2 非衍生化法 氨基糖苷类抗生素的非衍生化分析通常采用了新的检测技术:如示差折光检测法、UV末端吸收法、间接测定法、脉冲电化学检测器法、质谱检测法和蒸发光散射检测法(ELSD)等。新型检测器的使用扩大了hPLC非衍生化方法在氨糖类抗生素中的应用,相比之下,各有特点。近年来,在药学领域中广泛应用的蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型质量检测器,对任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,并且在一定条件下物理性质相似的物质其响应因子基本一致,可以满足样品有关物质检查和含量测定等多项药物质量控制的要求,专属性强、灵敏度高,在氨基糖苷类抗生素的分析中占有重要的地位。
3.3 气相色谱(GC)法 氨基糖苷类抗生素不具挥发性,需要提高温度用硅烷化试剂衍生化后进行GC分析。《USP》26版、《BP》2002年版中盐酸大观霉素的测定即采用六甲基硅烷衍生化后FiD检测。
3.4 毛细管电泳(CE)法 毛细管电泳是上世纪8O年代后期发展起来的一种分离分析技术,hPCE 是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据分离模式的不同,又可分为毛细管区带电泳(CZE) 、毛细管等电聚焦(CiEF) 、毛细管凝胶电泳(CEC) ,胶束电动毛细管色谱(MEKC) 等,具有分离效率高、速度快、样品用量少的特点。电化学检测器同样适用于CZE 技术,此法可同时检测7 种氨基糖苷类抗生素。此类抗生素的hPCE 检测方法,最为常用的仍然是柱前及柱内衍生的CZE 技术,然后进行紫外检测。
3.5 质谱法(MS) 电喷雾离子阱多级质谱法(ESi-MS)技术属于软电离方式,可在温和的条件下获得待测物的准分子离子峰。氨基糖昔类化合物在结构中含有多个伯胺或仲胺基团显弱碱性,在质谱上具有较强的正离子响应。ESi-MS 法不需要标准品即可对混合物中除同分异构体外的各组分进行定性和半定量分析,方法准确、快速、简便。
免疫分析法是近年来发展很快的一种方法,已用于生物样本中微量抗生素的快速鉴别。原子吸收光谱法(aSS) 方法用于庆大霉素注射液的测定,回收率在98.6%~103.0%之间。另外还有一些非专属性的理化测定方法(旋光法、分光法、容量法、量热法)的报道,主要用于制剂生产过程中的质量控制和溶出度研究。
4.氨基糖苷类抗生素有关物质的测定方法
氨基糖苷类抗生素有关物质主要为合成前体、异构化产物、其它副产物和储存期降解物,其结构与主成分较为相似。故能用于测量氨基糖苷类抗生素含量的灵敏度高、专属性强的方法,基本都可用于其有关物质的检测。基于检测方法的实用性和普及性,目前国内制药行业用于检测该类抗生素有关物质的最为常用方法主要为色谱法(TLC法, 柱前衍生hPLC法、柱后衍生hPLC法,hPLC-ELSD法),经综合分析近几年审评中心对氨基糖苷类抗生素已批质量标准中有关物质检查方法与限度的变化可以看出,氨基糖苷类抗生素的有关物质的测定方法正逐渐从经典的TLC法和影响因素众多的hPLC衍生化法向灵敏度更高、专属性更强的hPLC-ELSD发展。
相信随着我国经济的发展,药品质量研究的不断深入和药物分析工作者的不懈努力, MS 技术在定量方面的进一步完善, MS和LC、GC的联用将成为此类药物有关物质分析中一种必不可少的检测手段,最具有前景的将是CE-MS 联用技术。
