随着全球对nisin 需求量的日益增加，关于nisin产量及发酵周期的研究已引起人们越来越多的关注[2, 3]。目前人们主要研究的对象都集中在如何提高不同菌株nisin的最终发酵产量，大多并未考虑在发酵产量相同的条件下缩短发酵时间。本实验室目前的一部份工作着重于以nisin Z产生菌Lactococcus lactis N8为出发菌株，提高其单位时间内nisin的产出。在L. lactis N8中与nisin Z生物合成及调控相关的基因共有11个，这些基因成簇排列在一个约70 kb的转座子上即nisA/ZBTCIPRKFEG。在这些基因的产物中，NisBC负责nisin的翻译后修饰，NisT负责前体nisin的转运，NisP负责前导肽的切割和成熟nisin的释放，NisI和NisFEG负责生产菌株的自身免疫耐受性。同时，由于nisin是自体诱导表达产生，其成熟的nisin分子作为信号分子刺激双组分系统NisRK中的传感激酶NisK，进一步使得应答调节子NisR自体磷酸化并激活nisA和nisF启动子启动转录，整个基因簇转录表达最终大量产生nisin分子[4, 5]。
在糖酵解途径中Pfk基因[6]编码6-磷酸果糖激酶，该酶是糖酵解中的一个限速酶。已有文献报道pfk基因对糖酵解的速度有很大的影响，过表达pfk基因可以使6-磷酸果糖激酶酶活力提高两倍(从 7.1 U/OD600增到14.5 U/OD600)，细胞对葡萄糖的摄取也相应成比例的得到了提高(从 0.8 μmol/L·s-1·g·CDW-1增到1.7μmol/L·s-1·g·CDW-1)[7]。通过提高该酶的表达水平能够加快糖酵解的速度，从而提高蛋白的合成速度。pkaC基因[6, 7]编码以cAMP为依赖的蛋白激酶的催化亚基，其可以辅助pfk基因更好的行使功能。我们研究了在N8菌株中共表达pfk与pkaC基因后其生长的状况，比较了不同时间段nisin产量及胞内6-磷酸果糖激酶酶活的变化，并在转录水平上分析了其nisA转录量与野生菌株的区别。同时我们比较了不同葡萄糖浓度下野生菌及重组菌产nisin的变化。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒：大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)N8、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)A1 NCIMB86166、质粒pMG36e由本实验室保存。
1.1.2 培养基及培养条件：(1)L. lactis:SGM17 培养基，30℃静置培养[8];(2)E. coli: LB 培养基，37℃震荡培养[9];(3)M. luteus A1 NCIMB86166:S培养基,30℃静置培养[10]。(4)乳酸菌电转化复苏液：GM17MC(GM17+20 mmol/L MgCl2+2 mmol/L CaCl2)。(5)在E. coli中红霉素的使用浓度150 μg/mL，在L. lactis中的使用浓度5 μg/mL。
1.1.3 主要试剂和仪器：实验中所用抗生素购自鼎国科技生物有限公司；限制性内切酶,DNA marker，反转录试剂盒及PCR荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司；PCR 产物回收试剂盒，T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；质粒快速小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒及RNA快速提取试剂盒购自天根生物科技公司；PFK测定试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司；Nisin标准品为Sigma公司产品。上海分析仪器厂的752 型分光光度计,BioRad MicroPulser(25uF，200Ω)电转化仪。NanoDrop核酸蛋白分析仪，BioRad PCR仪，BioRAD 荧光定量PCR仪。
1.1.4 引物：本研究所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。
| Primer | Sequence (5’→3’) |
| pfk -F | CCCGAGCTCGTATTTTTGCTATGTATCTCAATT |
| pfk-R | CCCGTCGACTTAGTTAAGGTTAAGATTGTTGAGT |
| pkaC-F | CCCCTGCAGATTTCACTGTCGCAAATG |
| pkaC-R | CCCGGTACCAAAGTTATTTAGAAGCTTAAATT |
| Q-16S-F | AGAGTTTGATCATGGCTCAG |
| Q-16S-R | TAGGGTTACCTTGTTACGACTT |
| Q-nisA-F | CGGCTCTGATTAAATTCTGA |
| Q-nisA-R | TTGTAATGCGTGGTGATG |
| Q-pkaC-F | CAAGTACCGTAACTGGAA |
| Q-pkaC-R | GAAATAGGTGTCGTTGGA |
1.2.1 DNA的提取、酶切连接及感受态细胞制备：大肠杆菌质粒DNA的提取按天根公司说明书进行。DNA纯化及连接反应按Fermentas公司的说明书进行。DNA酶切反应条件按TaKaRa公司说明书进行。乳酸菌质粒提取所用方法参照文献[11]。E. coli感受态细胞的制备及转化采用CaCl2介导的方法[12]，乳酸菌感受态细胞制备和电击转化参照文献[13]。
1.2.2 pMG36e-pfk，pMG36e-pkaC，pMG36e-pfk-pkaC重组质粒的构建及转化：以L. lactis N8基因组为模板，分别用pfk-F/R 和pkaC-F/R扩增pfk及pkaC基因。反应条件：94℃2 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃5 min。使用SacI及SalI分别酶切质粒pMG36e与pfk基因片段，使用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态，并提质粒验证。将pMG36e及构建正确的pMG36e-pfk质粒和pkaC基因分别用PstI和KpnI双酶切，后分别连接转化DH5α感受态，提质粒验证获得正确的目的质粒pMG36e-pkaC和pMG36e-pfk-pkaC。将构建好的pMG36e-pfk，pMG36e-pkaC，pMG36e-pfk-pkaC质粒及空质粒pMG36e转入N8感受态。2.0 μL(80 ng)质粒加入50 μL N8感受态细胞混匀后加入0.2 cm电转化杯，在2.4 kV下电击转化。电击后立即加入800 μL电转化复苏液SGM17MC，混匀后吸出冰浴10 min，然后置于30℃培养箱复苏1 h，涂布于含红霉素5 μg/mL的SGM17培养平板，得到重组菌N8-pMG36e-pfk，N8-pMG36e-pkaC，N8-pMG36e-pfk-pkaC及N8-pMG36e。
1.3 重组菌及对照菌株生长曲线的测定将过夜培养的N8,N8-pMG36e-pfk、N8-pMG36e-pkaC、N8-pMG36e和N8-pMG36e-pfk-pkaC分别以1%的比例转接至新鲜的SGM17 培养基中，培养2 h后开始取培养液原液测定OD600,每隔2 h测定1次吸光度，每次重复3个平行[14,15]。
1.4 Nisin效价标准曲线的制作及发酵液上清效价的测定1.4.1 检测平板的制作：在50 mL三角瓶中装入20 mL S 培养基，灭菌后放入55℃水浴锅中，加入400 μL 50% 的吐温-20溶液(终浓度为1%)，并混合均匀，然后加入500 μL藤黄指示菌(OD600=0.4)，倒入外径90 mm的塑料培养皿中，培养皿中事先放入无菌牛津杯，培养皿需放在已调为水平的玻璃平面上，待平皿冷却后放入4℃冰箱中静置2 h,将平板中的牛津杯取出，平板备用。
1.4.2 Nisin标准液的配制和标准曲线的制作：用万分之一电子天平(AB104-N电子天平)称取20 mg左右的标准品，溶于酸水中，配制成终浓度为1000 IU/mL标准液，Nisin效价浓度在5 -100 IU/mL,其对数值与抑菌圈直径呈线性关系[16]，用无菌的0.02 mol/L HCl依次稀释成10、25、50、75和100 IU/mL。在已经打孔的S平板的孔内分别加入5种浓度的标准溶液150μL(每个浓度分别点3个平行孔)，将点样后的平板在超净台中吹干，然后倒置于37℃温箱中培养20 h。
1.4.3 重组菌N8-pMG36e-pfk-pkaC及野生菌株N8不同时间段发酵液上清nisin效价的测定：分别取培养4、6、8、10、12和14 h的菌液，用0.02 mol/L HCl将菌液分别稀释100倍，12400×g离心4 min,取上清液。80℃水浴处理10 min，在已经打孔的 S 平板的孔内分别加待测样品各150μL(每个浓度分别点3个平行孔)，将点样后的平板在超净台中吹干，然后倒置于37℃温箱中培养20 h。
1.4.4 测量和计算：将培养好的平板取出，用0.02 mm的游标卡尺测量抑菌圈直径大小。先以标准样品作出“lg效价-抑菌圈直径”的标准曲线，再利用标准曲线分别计算出待测样品的效价。
1.5 实时定量PCR检测nisA与pfk-pkaC基因转录水平以16SrRNA为内参基因(引物Q-16S-F/R)，检测nisA(引物Q-nisA-F/R)及pkaC(引物Q-pkaC-F/R)基因的转录。提取N8及N8-pMG36e-pfk-pkaC总RNA，用NanoDrop对RNA定量，按照反转录试剂盒说明进行反转，反转后立即进行荧光定量PCR。每个基因每个时间段的检测分别设置3个平行，使用2-△△CT法分析实验数据。
1.6 野生菌N8与重组菌N8-pMG36e-pfk-pkaC胞内6-磷酸果糖激酶酶活的比较胞内6-磷酸果糖激酶的测定按照PFK测定试剂盒说明书操作。酶活单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1 nmol 6-磷酸果糖和1 nmol ATP0 转化为1 nmol 1,6-二磷酸果糖和1 nmol ADP 定义为1个酶活单位。
1.7 野生菌N8及重组菌N8-pMG36e-pfk-pkaC在不同葡萄糖含量下培养产nisin的变化改变SGM17培养基中葡萄糖的含量，分别在M17中添加0.5%,1.0%，1.5%的葡萄糖培养N8-pMG36e-pfk-pkaC及N8，取培养10 h的发酵上清液分别做抑菌实验，检测抑菌圈的大小，每组实验做3个平行。
2 结果和分析2.1 重组菌与野生菌N8生长曲线的比较实验结果表明(图1)，在12 h内野生菌N8的生长速度快于含有质粒的4株重组菌，其原因可能是由于质粒的引入和外源基因的表达增加了细胞的负担，从而导致生长速度稍有减慢[14]。然而与N8-pMG36e相比，N8-pMG36e-pfk，N8-pMG36e-pkaC，N8-pMG36e-pfk-pkaC的生长速度并没有很明显的差异，说明pfk，pkaC及pfk-pkaC基因的过表达对N8的生长并没有明显的影响。
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| 图 1 野生菌N8与重组菌株的生长曲线Figure. 1 Growth curve of wild strain N8 and recombinant strains. |
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图选项
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2.2.1 4株重组菌株与野生菌培养相同时间发酵液上清抑菌效果的比较：为了排除pMG36e，pMG36e-pfk和pMG36e-pkaC质粒对nisin产生的影响，分别取培养10 h的4株重组菌及N8发酵上清液做抑菌试验(图2)，每组实验做3个平行(只列出1组实验图)。实验结果表明在培养到10 h时，转入pMG36e和pMG36e-pkaC质粒的菌株与N8相比抑菌圈没有明显的区别，重组菌株N8-pMG36e-pfk的抑菌圈略大于野生菌N8,而N8-pMG36e-pfk-pkaC的抑菌圈明显大于野生菌，从而排除了pfk基因，pkaC基因及空质粒pMG36e 对N8产nisin的影响。为后续的实验提供基础。
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| 图 2 重组菌与野生菌培养10 h时发酵上清液对藤黄微球菌A1 NCIMB86166 的抑菌效果Figure. 2 Antibacterial activity of supernatants of wild strain and four recombinant strains against Micrococcus luteus A1 NCIMB86166 after fermentation 10 h.M, 0.02mol/LHCl; 1, N8; 2,N8-pMG36e; 3, N8-pMG36e-pkaC; 4,N8-pMG36e-pfk; 5, N8-pMG36e-pfk-pkaC. |
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图选项
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2.2.2 N8与N8-pMG36e-pfk-pkaC不同生长时间发酵液上清抑菌效果的比较：由2.2.1的实验结果知道只有在pfk-pkaC基因共表达时才会对N8的抑菌效果产生明显的影响，在以下的研究中只对野生型菌株N8及重组菌株N8-pMG36e-pfk-pkaC不同时间段发酵液上清的抑菌活性做比较(图3)。N8及N8-pMG36e-pfk-pkaC的抑菌圈直径随着培养时间的增加在增大，在10h时两者的抑菌圈直径差别达到最大，重组菌大约是野生型菌株的1.1倍。随着培养时间的继续增加，两者抑菌圈的差别在逐渐缩小，在菌株生长的中后期重组菌与野生菌的抑菌圈几乎一致。由此可见在N8中过表达pfk-pkaC 基因可以增快nisin的产生，但并不能增加nisin的终产量。
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| 图 3 png重组菌与野生菌培养不同时间发酵上清液稀释100倍后的抑菌活性Figure. 3 Antibacterial activity of diluted 100 times supernatants after fermentation for different time.M,0.02mol/L HCl; A, N8;B,N8-pMG36e-pfk-pkaC;6,8,10, 12 and 14 are different fermentation time. |
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图选项
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用 0.02 mm 的游标卡尺测量抑菌圈直径大小(表2)，通过nisin标准曲线(图4)，分别计算出待测样品不同时间段发酵上清液nisin的效价(图5)。由效价图可见随着培养时间的增加，重组菌与野生菌的效价差值越来越大，在10h左右达到最大(P=7.01E-07＜0.01,差异极显著)，到14 h两者的效价几乎相等(P=0.05124>0.05,差异不显著)。这与2.2.2的实验结果一致。
| t/h | Wild strain inhibition zone/mm | Titer/(IU/mL) | Recombinant strain inhibition zone (mm) | Titer/ (IU/mL) |
| * indicates the difference is significant at the 0.05 level between wild strain and recombinant strain;**indicates the difference is significant at the 0.01 level between wild strain and recombinant strain. | ||||
| 2 | 6.68±0.06 | 124±1.8 | 6.78±0.08 | 127±2.9 |
| 4 | 9.76±0.04 | 260±3.1 | 10.36±0.10 | 300±5.5 |
| 6 | 14.44±0.11 | 800±21.3 | 15.36±0.08 | 1000±17.2* |
| 8 | 16.86±0.12 | 1430±41.3 | 17.6±0.06 | 1710±24.4** |
| 10 | 19.14±0.12 | 2480±61.5 | 20.08±0.05 | 3100±39.7** |
| 12 | 19.88±0.10 | 2960±48.2 | 20.18±0.07 | 3178±53.5* |
| 14 | 20.2±0.08 | 3200±54.1 | 20.26±0.04 | 3243±27.3 |
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| 图 4 Nisin 效价检测标准曲线Figure. 4 Standard curve of Nisin titer. |
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图选项
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| 图 5 野生菌和重组菌在SGM17培养基中培养的效价曲线Figure. 5 Titer curve of L. lactis N8 and L. lactis N8-pMG36e-pfk-pkaC in SGM17 medium. |
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图选项
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通过qPCR实验，从分子水平上揭示重组菌与野生菌nisA及pfk-pkaC转录水平的区别[17]。由实验结果可见，在10 h时，重组菌nisA的转录量约是野生菌的1.5倍，在12 h时两者的差异变得非常小，nisA的转录水平几乎一致(图6-A)。野生菌和重组菌在培养8、10和12h时，pfk-pkaC基因的转录维持在一个稳定的水平，而重组菌pfk-pkaC的转录量是野生菌的6倍(图6-B)。
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| 图 6 N8与N8-pMG36e-pfk-pkaC在8h,10h,12 h nisA(A)和pfk-pkaC(B)转录水平的比较Figure. 6 Real-time qPCR analysis of the expression of nisA(A)and pfk-pkaC(B) at 8h,10h and 12 h.* indicates the difference is significant at the 0.05 level between wild strain and recombinant strain;** indicates the difference is significant at the 0.01 level between wild strain and recombinant strain. |
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图选项
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由实验结果(表3)，可见N8及N8-pMG36e-pfk-pkaC在培养到10 h时胞内6-磷酸果糖激酶酶活达到最高，随后维持在一个稳定的水平，而重组菌在3个不同时间点的酶活都要显著高于野生菌N8，说明pfk-pkaC基因的过表达确实提高了重组菌胞内6-磷酸果糖激酶酶活。这与2.4pfk基因转录水平的分析一致。
| t/h | PFK activity of wild strain (U/104cell) | PFK activity of recombinant strain (U/104cell) | Relative increase of PFK activity/% |
| * indicates the difference is significant at the 0.05 level between wild strain and recombinant strain;**indicates the difference is significant at the 0.01 level between wild strain and recombinant strain. | |||
| 8 | 0.00102±0.00013 | 0.00201±0.00008* | 97.10 |
| 10 | 0.00159±0.00017 | 0.00258±0.00015* | 62.30 |
| 12 | 0.00154±0.00007 | 0.00247±0.00018* | 60.10 |
由实验结果(表4)，我们发现N8及N8-pMG36e-pfk-pkaC在3种不同葡萄糖浓度培养下的效价分别一致，同时重组菌的效价要高于野生菌，与2.3实验结果一致。
| c(Glucose)/% | Wild straininhibition zone/mm | Titer/(IU/mL) | Recombinant straininhibition zone/mm | Titer/(IU/mL) |
| P＞0.05 indicates the difference is not significant; P＜0.05 indicates the difference is significant. | ||||
| 0.5 | 19.08±0.04 | 2439±24.2 | 20.08±0.02 | 3100±10.4 |
| 1.0 | 19.1±0.02 | 2451±11.1 | 20.04±0.05 | 3071±19.3 |
| 1.5 | 19.1±0.03 | 2451±16.620.06±0.04 | 3087±30.7 | |
| P>0.05 | P>0.05 | |||
本研究通过过表达糖酵解途径中限速酶6-磷酸果糖激酶提高了L. lactis N8单位时间内nisin的产量。尽管随着菌株中nisin量的积累，造成发酵后期重组菌与野生菌发酵水平的差异并不显著，但通过抑菌实验及nisA的荧光定量PCR分析，重组菌nisin的产量在菌体生长的稳定期初期(10h)就得以提高并基本达到最大值，比同时间段野生菌提高了20%，可缩短发酵周期，提高生产效率。由于pfk基因是糖异生途径中的1个限速酶基因，pfk基因的过表达可以提高胞内6-磷酸果糖激酶酶活，加快乳酸乳球菌N8能量的产生，利于蛋白质的快速合成。然而pfk基因只是3个关键酶基因中的1个，其过表达并不能完全改变糖异生途径的限速步骤大大提高nisin的产生速度。本研究中重组菌并没有明显提高nisin的终产量，为了研究是否葡萄糖的含量限制了最终的nisin产量，我们分别在M17中添加了0.5%、1.0%和1.5%的葡萄糖去培养N8-pMG36e-pfk-pkaC及N8，实验结果显示野生型菌株及重组菌株在3种不同糖含量的SGM17培养基中生长,它们的nisin终产量维持在相等的水平，这表明pfk-pkaC基因的共表达并没有提高菌株对葡萄糖的利用。这可能由于乳酸乳球菌是兼性厌氧菌，其对底物葡萄糖的利用率本身就不高，自身对底物利用的限制引起的。我们研究室也正致力于改变N8的相关代谢通路，提高其对相关底物的利用率，从而提高nisin的终产量。
近年来，随着食品化学添加剂及医用抗生素的大量使用[18]，带来的一些诸如食品安全及临床超级耐药细菌的问题已经引起了人们的广泛关注[19]。用高效、无毒的天然抗菌肽取代传统的化学合成防腐剂及相关抗生素的使用是保障人类健康的迫切需要，也是世界潮流发展的大势所趋。为了能更好地推动nisin的广泛应用，如何进一步提高nisin产生菌的发酵效价及产量、降低生产成本等方法措施成为乳链菌肽研究者和生产者面临的重要课题。而本研究通过对pfk基因的过表达从而增快nisin的产出，为发酵周期的优化及生产效率的提高提供了一些新的思路。
