结冷胶的发酵生产及其特性

一、结冷胶的结构组成及其类多糖

     结冷胶（Gellan Gum）是一种从水百合上分离所得的格兰氏阴性菌——伊乐藻假单胞杆菌（Pseudomonas elodea），后确认为少动鞘脂单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)所产生的胞外多糖，经过发酵、调PH、澄清、沉淀、压榨、干燥、碾磨制成，结冷胶为分子量高达100万左右的阴离子型线形多糖，具有平行的双螺旋结构，结冷胶的单糖分子组成是葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸，分子组成大约为2：1：1。主链是一个线性四糖重复单位，组成结冷胶胶体链的4个基本单元分别是：β（1→3）-D-葡萄糖 ;β(1→4)-D-葡萄糖醛酸;β(1→4)-D-葡萄糖;α(1→4)-L-鼠李糖.即每一基本单元包括一分子鼠李糖和葡萄糖醛酸以及两分子葡萄糖，其中葡萄糖醛酸可被钾、钙、钠、镁中和成混合盐。其相对分子质量约为5×105。直接获得的结冷胶产品在分子结构上带有乙酰基和甘油基团，即天然结冷胶在第一个葡萄糖基的C-3位置上有一个甘油酯基，而在另一半的同一葡萄糖基的C-6位置上有一个乙酰基。如果将获得的产品用碱处理（pH10条件下）并经加热处理，可除去分子上的乙酰基和甘油基团，就可以得到用途更广的脱乙酰基结冷胶（一般所称的天然型结冷胶，是指乙酰基形式的结冷胶，而普通所指的结冷胶则是指脱掉乙酰基的结冷胶）。一般说来，天然结冷胶（带有乙酰及甘油基团）形成柔软的弹性胶，而脱乙酰结冷胶则形成结实的脆性胶（类似于琼脂胶）。

结冷胶是组成与结构类似的8种微生物多糖中的一种。这8种微生物多糖为：结冷胶、沃仑胶、鼠李胶、S-657、S-88、S-198、NW-11、PS-P4，它们具有相同的主链结构，所不同的是它们的侧链基团的数目和位置以及含有或不含有乙酰基。这8种微生物多糖的主链上均有上述四糖重复单位，被称为结冷胶类多糖。结冷胶类多糖中四糖重复单位上某一单糖成分的改变，或者带有侧链基团都会改变其理化性质。结冷胶类多糖在水溶液中的物理性质差别很大，但它们的水溶液一般都具有高粘性和高热稳定性。

在水溶液中结冷胶形成高粘性或弱的凝胶，但经碱脱乙酰基处理后在不同阳离子的情况下，可形成硬而脆的凝胶。结冷胶多糖链平行排列成半交错的互相缠绕的双螺旋结构，每个多糖链形成一个左手三叠螺旋，两条螺旋通过氢键相互作用来稳定。结冷胶形成凝胶以及其强度和稳定性依赖于溶液中阳离子类型和浓度、乙酰化程度不同而异。其他结冷胶类多糖不能形成凝胶，即使含有乙酰基的胞外多糖脱去乙酰基后也不能形成凝胶，但它们的水溶液与黄原胶比较，表现出明显的低剪切率和良好的热稳定性。与结冷胶类似，大多数结冷胶类多糖均为半交错的双螺旋构型。其余结冷胶类多糖不能形成凝胶显然是由于双螺旋结构中不同的侧链及主链阻止了乙酰基在双螺旋结构中的聚集，因而抑制了凝胶的形成。结冷胶类多糖中的每一种多糖，其固有的粘性(随着离子强度不同而变化)依赖于它们的结构和是否存在乙酰基。

二、 结冷胶的特性

结冷胶含O-酰基，碱处理易于除去该基团。天然或称乙酰化结冷胶生成弹性凝胶，而低酰结冷胶(在pH10或更高情况下加热处理获得的产品)在加热后冷却得到脆性凝胶。天然结冷胶也含有纤维素物质，可通过离心或过滤除去。典型的纯化过程能产生3种基本类型的结冷胶，即天然结冷胶(或称未碱处理结冷胶)、低酰基结冷胶(或称碱处理结冷胶)和低酰基纯化结冷胶。天然结冷胶形成弹性凝胶，而脱酰基结冷胶在阳离子存在时，在加热后冷却时生成坚实脆性凝胶。由于多糖含量较高，纯化产品的功能性比未纯化产品强。

结冷胶能溶于冷水，但形成凝胶的条件是（1）需要先加热；（2）有一定量的盐离子存在。这样结冷胶溶液才会冷却后形成热可逆型凝胶，凝胶的强度、形成温度及融化温度都与盐离子浓度和种类密切相关。凝胶有良好的稳定性，耐酸，耐高温，热可逆，还能抵抗微生物及酶的作用。在高压蒸煮和烘烤条件下都很稳定。在酸性产品中也很稳定，而以PH在4.0～7.5条件下性能最好。贮藏时其质构不受时间和温度的变化而变化。结冷胶使用方便，略加搅拌即分散于水中，加热即溶解成透明的溶液，冷却后，形成透明但坚实的凝胶。

结冷胶是一种线性聚合物，当有电解质存在时可形成凝胶。无论是单价阳离子，如钠和钾，还是二价阳离子，如镁和钙，都可用于与低酰基型结冷胶生成坚实、脆性凝胶。但是最大凝胶硬度和模数是在非常低的二价阳离子浓度时产生的。大约0.5mM的钙和镁离子等于约150mM钾和钠离子在0.5％凝胶中所生成的最大凝胶模数和硬度。低酰基型结冷胶凝胶的模数和硬度随胶浓度的增加而增加，而凝胶脆性和弹性保持相对不变。而纯化产品由于较高的多糖含量，在任何特定胶浓度时都有较高的硬度和模数。很明显，胶浓度、离子浓度是相互依存的两个参数，可用于调节产生最佳凝胶硬度和模数。

可见结冷胶对于钙、镁离子特别敏感，用钙、镁等二价离子做离子源形成凝胶要比用钠、钾等一价离子有效得多，钠盐和钾盐也可导致凝胶，但其所需浓度约比二价离子大25倍，且这类凝胶是热可逆的。如果用于溶解结冷胶的水相中已含有（或已添加）一定量的盐离子，尤其是钙、镁等二价离子，即使加热到100℃也很难再使得结冷胶充分水化，因此正确的方法是在去离子水中的结冷胶热溶液中先加入一定量的电解质（通常为钙盐或镁盐），并冷却后才会得到凝胶。所以一般是先将结冷胶在去离子水中加热至70～75℃水化，如需凝胶，则可在该温度或大于该温度时加入电解质，这时尚不会形成凝胶，一直冷却至40～50℃时方能形成凝胶，钙离子的最适浓 度为4～6mmol，这种凝胶再加热时不会熔化，如要使结冷胶溶于含有无机盐的自来水中，特别是碳酸钙含量高于1.8×10-４以上的硬水时，则需加入螯合剂来降低水中有效钙离子浓度，如柠檬酸钠或柠檬酸氢钠。螯合剂可与阻止结冷胶水化的钙、镁离子结成复合物。

应用时，如果水中的钙离子含量超过0.004%，就应该使用柠檬酸钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠（TSPP）等螯合剂，其用量还需考虑体系中形成凝胶需要的钙、镁等二价离子浓度。螯合剂控制凝胶强度的机理与海藻酸盐一致，通常选择在中性PH值下只能微溶的二水硫酸钙为钙离子源，采用干法与柠檬酸钠等螯合剂并与结冷胶一起混合，溶解于冷水中并加热使其充分水化后，再趁热加入柠檬酸；由于酸性条件下二水硫酸钙的溶解度加大，有效钙离子随时间不断增加，使得冷却后形成的凝胶强度不断上升。使用螯合剂还能使结冷胶溶解于含60%的蔗糖或高果糖浆的热溶液中，体系中含有蔗糖有助于提高结冷胶的透明度。

温度上升时结冷胶溶液粘度迅速下降，但冷却后粘度又能完全恢复，当温度降低到体系的凝胶形成温度后即能迅速形成凝胶，结冷胶的凝胶形成温度取决于胶浓度及盐离子浓度，离子浓度增加导致凝胶形成温度上升，同时也使得凝胶强度加大，但超过一定范围后（与离子种类有关）凝胶强度开始下降.与琼脂凝胶类似，结冷胶也有凝胶温度与融化温度之差，融化温度值也与体系中的离子浓度及种类有关，其范围在70～130℃之间，使用含钙离子0.03%的0.2%的结冷胶溶液，凝胶的融化温度就可高达120℃以上。

   添加凝胶型水溶胶到低酰基结冷胶中会产生非常有趣的结构变化,比如，黄原胶－槐豆胶被认为是弹性胶性凝胶，按黄原胶－槐豆胶在混合物中所占比例不同，添加后不仅降低低酰基结冷胶的硬度和模数，而且降低脆性和增强弹性。类似的凝胶结构变化在添加瓜尔胶(结构上与结冷胶有些相似)到黄原胶－槐豆胶后也能明显观察到。

结冷胶另一有意义的特点是它可形成热可逆凝胶，类似于琼脂和明胶，也能形成盐诱导的凝胶，类似海藻胶和卡拉胶。这些性质进一步增加了结冷胶应用的多样性，比如，低酰基结冷胶溶于去离子水或有一种多价螯合剂存在时溶于低离子强度溶液，随后加入二价阳离子就可制备冷水凝胶。另外如同海藻胶一样，结冷胶能用于制备自凝胶化复配胶。结冷胶特有的性质是能在极低的用量下（0.05%）即可形成澄清透明的凝胶，它的用量通常只为琼脂和卡拉胶用量的1/2至1/3，通常用量为0.1％～0.3%。制成的凝胶富含汁水，具有良好的风味释放性，有入口即化的口感。

     这些性质显示，结冷胶在食品系统中具有广阔的应用范围。结冷胶浓度在0.1％～0.5％能形成高质量的凝胶，并能与其他食品配料配伍。在常见食品的pH范围内，结冷胶凝胶的性质只有很小的差异，在pH3.5～7.0时，结冷胶凝胶对酶分解有很高的抗性。结冷胶凝胶的凝固温度在30～45℃范围内，而凝胶熔化温度既可低于又可高于100℃，这取决于是在何种条件下生成的，在这方面，凝胶化所需阳离子类型和浓度特别重要。低酰基结冷胶凝胶和其他凝胶在食品应用中的相似性将能使结冷胶取代或部分取代现行商业应用中的凝胶剂。在许多情况下，有重要意义的事实是结冷胶的应用浓度远低于现行商业化水溶胶的使用浓度。

 三、结冷胶发酵生产技术简介

Gellan Gum是开发的一种新型微生物多糖，这使得获得1993年食品科技人员学会（IFT)颁发的食品科技工业成就奖，这是该行业继大约20年前以黄原胶研究开发获得该奖后的再次获奖。

 由于在微生物发酵和食品胶研究方面具有丰富的经验和实力，也由于黄原胶的研制成功，同时根据市场需求，使这个行业再一次投入大量的人力、物力去研制一种更为理想的食品胶，而待开发的这种食品胶应尽可能满足以下一系列的设想：使用简便，最佳的风味释放，高热稳定性，入口融化；透明度高，凝固的时间和温度可变动，不需或稍微加热即可成凝胶，凝胶不受PH值影响(pH值介于3.2～7.5之间)，产品稳定，具有多样的组织特性等。在菌株筛选过程中，行业搜集了世界各地的泥土和水样进行分析研究，筛选出三万多种能产生胶质的菌种，其中有一千多种菌种能产生有效的胶质。经过数年的研究，最终分离出一新的微生物菌株—Pseudomonas elodea，它产生的胶质符合当初的大部分设想。然而，在扩大试验过程中，试验人员又碰到了这样一些问题：制造和澄清困难、产率低等。这使得行业公司几乎要放弃Gellan Gum的研究，可喜的是，行业专家最终解决了这些难题。随着数年的放大生产研究、生物毒性喂养试验和长期的喂养试验的成功，FDA终于批准了Gellan Gum应用于食品中。此外，日本也于1988年批准Gellan Gum应用于食品中，而到目前为止，允许Gellan Gum作为食品添加剂使用的国家和地区有香港、韩国、泰国、中国、中国台湾、菲律宾、澳大利亚、新西兰、中东、拉美等。

（一）生产菌种

结冷胶生产菌是从上万个土壤、水样、空气、植物体或动物体组织中分离获得的.结冷胶的生产菌—伊乐假单胞杆菌(ATCC31461)是从植物体中分离出来的，少动假单胞菌可以从土壤中(其中两株可以降解木质素和聚氯二苯基)，从植物体中、从医院临床标本和水样中得到。从生物技术观点来说，少动鞘脂单胞菌最重要的共同特征是分泌结冷胶、沃仑胶、鼠李胶等结冷胶类胞外多糖。既然这类微生物能够分泌特别的有潜在商业应用价值的多糖，有理由期望能够分离到新的少动鞘脂单胞菌，能够生产主链结构相似但流变特性不同的具有商业应用价值的胞外多糖。

（二） 结冷胶合成的生物途径

 微生物胞外多糖的生物合成因菌种不同而发生在生长的不同阶段和环境条件下。按合成位点和合成模式的不同，微生物胞外多糖的生物合成分两种类型，即同型多糖的合成与异型多糖的合成。

异型多糖如黄原胶、结冷胶等的合成是在细胞内进行的、比同型多糖的合成复杂。异型多糖的合成体系包含5个因子，即糖基-核苷酸、糖基供体、脂中间体、酶系统及糖基受体。研究者提出了由伊乐假单胞菌合成结冷胶的可能途径。提供糖基—核苷酸的活性体假定为LDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖和UDP-葡萄糖醛酸作为重复四糖单体，合成结冷胶的中间供体。涉及前体合成的酶有磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、TDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP－葡萄糖脱氢酶和TDP-鼠李糖合成酶。有利于结冷胶合成的条件是增加前体合成酶的水平，这些酶的水平与结冷胶产量相关．同时前体合成下游的相关催化步骤的作用也不容忽视。伊乐假单胞杆菌糖代谢主要经由糖酵解途径和磷酸戊糖途径。葡萄糖转变为葡萄糖醛酸或葡萄糖-4-磷酸醛、然后转变为6-磷酸葡萄糖醛酸。

（三）结冷胶的提取和纯化

 结冷胶生产是高粘性代谢产物的微生物发酵过程，胞外多糖围绕细胞以粘性聚合物形式形成网状结构。因此用简单方法难以将胞外多糖从细胞周围分离、既使在大量稀释后也难以分离出来

提取多糖的一般方法是将发酵液稀释若干倍以降低其粘性．然后通过离心分离作用分离多糖，几次冲洗和离心分离步骤是必不可少的。因为对于可靠的测定方法来说，在第一次离心分离时，清液中的多糖浓度往往太低，而异丙醇和乙醇常用来沉淀多糖。大多数研究者通过冷冻、干燥或超速离心来浓缩结冷胶。浓缩物用5mol/L三氯乙酸处理除去蛋白质，然后用5mol/L氢氧化钠中和。也有报道在80℃～90℃高温下加热发酵液，然后用异丙醇沉淀可以增加多糖的提取率。对用于沉淀多糖的溶剂的要求大多依赖于发酵液的体积而不是结冷胶的浓度。超滤被用于浓缩上清液，然后用1％KCl处理可以大大减少沉淀作用时使用的溶剂量，但是可观察到膜污染和结冷胶的损失现象。

其他有效的提取胞外多糖的方法有：不加搅拌地滴加一定量的表面活性剂到发酵液中进行相分离，然后回收包含较纯多糖的上清液。表面活性剂为离子型或非离子型，比较适宜的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)，以15g／L浓度添加到1g／L多糖的溶液中。通常通过异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶剂多次沉淀和多次在水中溶解来纯化多糖。

                        —摘自《功能性食品胶》（第2版，2014，化工出版社, 胡国华主编），有较多删节和修改。