结冷胶（Gellan Gum）是一种细胞外生物高分子多糖类物质，以葡萄糖等单糖或双糖为原料，以少动鞘脂单胞菌为产生菌，经特定的生物发酵制成[1]。我国在1996年批准其作为食品增稠剂、稳定剂使用，2011年发布实施了结冷胶国家标准GB25535-2010[2]。经少动鞘脂单胞菌发酵后的发酵液，未经脱酰基处理所得到的即为高酰基结冷胶，而直接加热加碱脱去酰基的为低酰基结冷胶。作为一种新型的微生物胞外多糖，高酰基结冷胶具有生产周期短、不受地理环境和气候条件的限制、理化性质独特、安全无毒等优势，且其凝胶性能优越，在食品、制药、化工等领域有着广泛的应用前景[3]，具有重要的商业价值。
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近年来，国内低酰基结冷胶性能大部分已达到美国Kelco水平，而对高酰基结冷胶研究较少[4]，高酰基结冷胶生产工艺研究方面，仅有张士楚等[5]、张禹等[6]、王学刚等[7]专利3篇。笔者通过对结冷胶发酵配方的优化改进，筛选出一种适合生产高酰基结冷胶的发酵配方，为其规模化生产奠定了一定的基础。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
1.1.1供试材料。菌种：结冷胶菌种G11.3-9（实验室保藏）。试剂：豆粉（自制）、牛肉膏、蔗糖、鱼蛋白胨、葡萄糖，乳糖，KH2PO4，KCl，MgSO4·7H2O，FeSO4·4H2O，CaCO3，CaCl2，CaSO4·2H2O，试剂均为分析纯。种子培养基：葡萄糖1.0%，NaCl 0.5%，鱼蛋白胨0.6%，牛肉膏0.3%，pH值为7.0~7.2。发酵培养基：蔗糖2.75%，鱼蛋白胨0.25%，磷酸盐0.10%。
1.1.2供试仪器。HIQ-150型生物摇床，武汉江城生物科技有限公司生产；微生物发酵罐，江苏科海生产；LS-30型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；DV-Ⅱ型粘度计，美国Brookfield公司生产；电子显微镜，CX21FS1，日本OLYMPUS公司生产；精确到0.001 g的电子天平；精密酸度计，PHS-3C型，上海大普仪器有限公司生产；均质机；质构仪，BROOKFIELD CT3型。
1.2试验方法
1.2.1培养方法。①种子液制备。取实验室保藏的结冷胶菌种菌悬液0.5 mL，接入装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置恒温摇床培养，转速260 r/min，温度（30±1）℃。②发酵摇瓶培养。取5 mL活化好的种子液，接入装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，转速为260 r/min，温度为（30±1）℃，于摇床中培养。③发酵罐培养。装培养基40 L于50 L发酵罐，温度（30±1）℃，pH值7.0～7.2，接种量5％（v/v），调节空气流量和转速控制溶氧，为控制pH值，过程添加20%NaOH溶液。
1.2.2测定方法。①发酵液粘度测定。除有说明外，在25 ℃，4号转子，30 r/min条件下测定；②还原糖测定（GB50097-85）；③胶体收率测定。采用乙醇沉淀法。④胶体纯度测定参见GB 25535-2010[8]胶体性能测其悬浮性能以及弹性。
1.2.3单因素试验。①碳源。分别用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作为碳源，其他组分相同，制成发酵培养基进行摇瓶发酵培养，60 h后测定发酵液粘度、胶体收率、胶体性能，确定最佳碳源。②氮源。分别用豆粉、豆饼粉、鱼蛋白胨、玉米浆、鱼蛋白胨作为氮源，其他组分相同，制成发酵培养基进行摇瓶发酵培养，60 h后测定发酵液粘度、胶体收率、胶体性能，确定最佳氮源。③无机盐。分别用KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·4H2O、KCl、Na2HPO4作为无机盐，其他组分相同，制成发酵培养基进行摇瓶发酵培养，60 h后测定发酵液粘度、胶体收率、胶体性能，确定最佳无机盐。④钙盐。分别用CaCO3、CaCl2、CaSO4·2H2O、Ca（NO3）2·4H2O作为钙盐，其他组分相同，制成发酵培养基进行摇瓶发酵培养，60 h后测定发酵液粘度、胶体收率、胶体性能，确定最佳钙盐。
1.2.4正交试验。根据高酰基结冷胶发酵条件单因素优化试验结果，选出最佳的碳源、氮源、无机盐、钙盐，设计4因素3水平正交试验，选用L9（34）正交表进行正交试验（表1）。
2结果与分析
2.1发酵培养及优化
2.1.1碳源。如表2所示，以蔗糖、葡萄糖作为碳源，结冷胶的发酵粘度均较高，分别达到17 300、15 300 cp，粗胶收率均较高，分别达到1.65%和1.59%，说明蔗糖是结冷胶发酵的最佳碳源，葡萄糖次之。
2.1.2氮源。结冷胶产生菌在以鱼蛋白胨作为氮源时，如表3所示，其胶体的发酵粘度及粗胶收率明显高于其他氮源，故结冷胶发酵最佳氮源为鱼蛋白胨。
2.1.3无机盐。KH2PO4作为无机盐时，如表4所示，结冷胶的发酵粘度及粗胶收率均最高，分别达到18 000 cp和1.64%，其次是MgSO4·7H2O。
2.1.4钙盐。在结冷胶发酵培养基中加入各种钙盐，结果如表5所示，以加入CaCO3的效果最好，粗胶收率和发酵粘度均最高，分别达到1.52%和15 900 cp。
2.1.5正交试验。正交试验结果如表6所示。由表6可知，影响结冷胶发酵因素的顺序为B＞A＞D＞C。得出的结冷胶发酵最佳配方为：A2B3C3D1，即鱼蛋白胨0.25%，蔗糖2.75%，CaCO3 0.12%，KH2PO4 0.10%。
2.2发酵罐试验
利用摇瓶优化得到的发酵配方在50 L发酵罐中发酵生产结冷胶，发酵罐温度30 ℃，搅拌速度（120～250）r/min，pH值控制在7.0～7.2，如有必要，加入氢氧化钠溶液调整；发酵结果如表7所示。
利用50 L发酵罐中的发酵液酸沉→乙醇一次脱色→均质→调整pH值→均质→过滤→乙醇二次脱色→过滤→烘干，胶体收率比粗胶收率普遍低0.15%～0.20%，但纯度、悬浮性能、胶体弹性均能达到要求标准。
3结论
通过高酰基结冷胶发酵生产工艺优化研究，试验得到的高酰基结冷胶最佳发酵培养基配方为：氮源为鱼蛋白胨0.25%，碳源为蔗糖2.75%，无机盐为KH2PO4 0.10%，钙盐为CaCO3 0.12%，粗胶收率可以达到1.75%，胶体纯收率可达1.55%，理化指标、微生物指标、悬浮性能、胶体弹性[9-13]均能达到相关要求标准。
4参考文献
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