冬虫夏草等药用真菌液体发酵研究进展
摘要：文章论述了药用真菌深层发酵研究进展，包括目前药用真菌深层发酵培养方法、药用真菌液体发酵产物主要用途、菌种的优化、发酵产物的分析测定。
目录
1 药用真菌发酵培养方法
2 药用真菌液体发酵产物主要用途
3 菌种的优化
4 发酵产物的分析测定
5 总结
关键词：药用真菌 液体发酵
随着生活水平及科技水平的提高和市场对许多药用真菌产品需求的增大，传统的药用真菌栽培方式已不能满足市场对药用真菌产品的需求，液体发酵技术在药用苗上的应用便应运而生。液体发酵技术是在抗生素工业发展起来后才运用到药用真菌发酵中的。其优点是可以进行工业化连续生产、规模大、产量高、发酵周期短、生产效率高。药用真菌在液体发酵过程中，除菌丝或孢子会大量增殖外，还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种具有生理活性的物质。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官具有防病治病的作用。并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。在液体发酵领域内，研究人员正在试用不同的方法来实现改进发酵过程的条件，促进发酵过程朝向提高目的产物的方向进行，提高产物品质，降低发酵成本，使投入产出比达到最小的目标。
1 药用真菌发酵培养方法
药用真菌液体发酵生产工艺流程沿用了传统的发酵生产工艺，即试管斜面菌种→一级摇瓶种→二级种→三级种→发酵罐。有关培养基配方方面的研究包括碳源、氮源 碳氮比、pH值、无机盐、微量元素、维生素、生长因子、增粘剂等；有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌速度、空气流量、糖含量、pH值、纯度、活力、菌丝形状、发酵罐中菌丝体个数和重量等。在这些方面，人们对不同药用真菌的深层发酵进行了研究。
1.1 灵芝
改变灵芝液体发酵条件，结果表明其最适温度、摇瓶装量、转速、培养初始pH分别为25℃ 、100～120 ml／500 ml三角瓶、120～150 rpm、4.5～ 5.0，适宜的碳、氮源分别是玉米粉、黄豆饼粉，最适浓度分别为3% 、2.5%。研究还发现摇瓶培养过程中菌丝球直径在0.85～0.9mm时，菌丝体得率最高。pH值在灵芝深层发酵中对灵芝胞外多糖形成有影响，当起始pH 为5.5时，有利于胞外多糖的形成，发酵过程中控制pH 4．0时，胞外多糖的产量最大。另外，采用正交设计实验改变发酵条件，筛选出灵芝优化培养基为：葡萄糖3.6% 、蛋白胨0.4% 、pH 6.0、酵母膏0.2% 、KH2PO4 0.1% 、MgSO4•7H2O 0．05% 、VitB1 0.005% ，每升发酵液产干菌丝体15.6 g，粗多糖0.75g。
1.2 冬虫夏草
分离纯化后的野生蛹虫草划斜面菌种，经液体培养获得的菌球，可在米饭培养基上成功地培育出子实体。进一步实验结果显示蛹虫草胞外多糖的最佳培养基为：玉米粉4%，黄豆粉0.6%，酵母汁0.3% ，K2HPO4 0.05% ，MgSO4 0.05% ，接种量3% ，pH5.5。在25℃ 培养144 h，胞外多糖产量可达1.83g/L。试验中发现碳源因子对多糖产量影响极显著，C/N（碳氮比）高，有利于次生代谢物的积累。
近年来，应用生物技术发酵工程，进行了冬虫夏草发酵生产，其培养基配方为葡萄糖2.5% ，蛋白胨0.7% ，玉米浆0.5% ，酵母粉0.5% ，CaCO3 0.15% ，KH2PO40.15% ，pH 自然，培养的虫草菌丝体含甘露醇3.36% ，与天然的冬虫夏草成分相似，用于代替野生冬虫夏草，较大程度上解决了目前野生冬虫夏草的供应不足的状态。
1.3 茯苓
茯苓液体发酵的最适发酵培养基为：葡萄糖30 g，酵母浸膏3.9 g，蛋白胨5.1g，K2HPO4 1g，MgSO4•7H2O 0.5 g，水1L。茯苓液体发酵的最适培养条件为：培养温度26℃，摇瓶装量60 ml(250 ml三角瓶)，转速150r／min，培养基初始pH值5.5，液体菌种菌龄2d，液体菌种接种量6%，摇瓶培养时间7d。
1.4灰树花
灰树花液体深层培养最适宜的碳源为豆粉+麸皮，氮源为蛋白胨、牛肉膏，pH5.3～6.0，通气量为1：(1.0～1.4)。发酵液起始pH为8最适宜，终止pH为3.5，菌丝最适宜生长的pH为5.0。为确定灰树花深层发酵的工艺条件，掌握温度、pH、通气量、培养基粘度、菌龄及接种量对菌丝体生长的影响，经过试验得知，QF培养基，25℃ ，pH4.5，装量60ml／500ml三角瓶，转速100r／min，接种量≥l2% ，种子培养基中加0.4% 的CMC，可提高菌丝量。培养基添加生长促进剂板栗壳煮汁后，菌丝的增产率达140%。为进一步提高胞外多糖的产量，重复利用第一次发酵后的菌丝体是一种很好的方法。当总糖浓度一定时补料可提高胞外多糖的产量，补糖最佳时机为发酵84小时后补加葡萄糖，使发酵液浓度达5% ，可使胞外多糖产量最高达1.3g/L。菌丝体回收利用次数以2次为宜。
1.5蜜环菌
试验中改变蜜环菌液体发酵培养基的碳、氮源浓度，通过测定生长菌丝干重，获得最适培养基配方为：未脱脂蚕蛹粉1.5%，豆饼粉1.5%，蔗糖2.0%，乙醇1.0%。蜜环菌摇瓶液体发酵的最适温度为26℃、盛液量为140ml／500ml三角瓶、摇瓶转速为150r/min、培养基起始pH5.5。发酵条件为：温度26～28℃，搅拌转速200r/min，空气压力40－50kPa，V(发酵罐)：V(无菌空气／min)：1：0.4，4～5d为最佳发酵时间。结果显示菌体生物量受氮源影响明显。以廉价易得的农作物产品红薯粉作为碳源菌丝，得率为15.4L，NH4CI作为氮源菌丝，得率为13.8 L。研究发现液体摇瓶培养过程中，产生色素和香味物质的多少与培养基的碳、氮源种类有关。研究还发现在培养基中添加10%～30%(V/V)的泥炭水解液对蜜环菌的生物合成有促进作用，振荡培养形成球型菌丝体，静置液体培养有利于菌索形成。
1.6 金耳
研究表明，金耳液体发酵最适培养基组成为：玉米粉2%，蔗糖3%，酵母膏0.1% ，KH2PO4 0.1% ，MgSO4 0.05%；培养基最佳初始pH值、250ml三角瓶装量、接种量、菌龄分别是3.5、80ml、10% 和120h；用10L 发酵罐发酵时，菌龄是影响菌丝产量的关键因子，其次是温度和接种量，通风量的影响最小，培养的最佳条件是菌龄144h、28℃、接种量10%、通风量2.5L/min。
2 药用真菌液体发酵产物主要用途
2.1 作为液体菌种
利用深层发酵工艺生产药用真菌菌种，生产条件稳定．有利于机械化、自动化 菌丝体生长均匀一致、菌龄整齐、周期短、流程快、产量高。把液体菌种接入固体培养料时，又具有流程快、易分散、萌发快、发菌点多等特点。目前已经对黑木耳、香菇、灵芝、竹荪、羊肚菌等药用真菌进行了实验，并用于生产实践。
2.2 用于药品、保健品生产
利用发酵技术获得的菌丝体的营养成分和特殊成分的含量以及疗效和保健功效等均和子实体有相似，有些特殊成分的含量还远远高于子实体。日前，市场已有许多这类药物出售，如：安络痛片、香云片、是芝片、蜜环菌片等，都是用液体发酵方式获得菌丝体成分制成。
2.3 提取利用代谢产物
药用真菌液体深层发酵物可以提取如多糖、多肽、生物碱、萜类化台物、甾醇、苷类、酚类、酶、核酸，氨基酸、维生素、Mn-SOD、具抗生素作用的化合物以及植物激素等生理活性物质。例如尚德静(1996)采用灵芝、金针菇、香菇和猴头菌深层发酵的方法．利用药用真菌在生长过程中分泌产生的纤维素醣、果胶酶、蛋白酶对花粉壁进行生化处理，最终使花粉破壁，破壁率达70% －80% 以上。
3 菌种的优化
为了提高液体深层发酵的水平，获得更多有效产物，除了探索最佳的培养条件外，菌种的优化也是一个关键。在选育优良菌种时，通常使用方法有：
3.1紫外诱变技术
以灰树花为例，用灰树花Gr 9801为出发菌株，采用紫外线连续诱变，经分离纯化、驯化等方法，以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标，筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的灰树花菌株－－GrUV 04，该菌株在综合PDA培养基上生长速度快，菌体丰满纯白。驯化后在液体培养基中发酵生长力强，生物量达1.97% ，发酵多糖总量达216mg／100 ml。分别较出发菌株提高129.1% 和75.6%。对灵芝原生质体进行了紫外诱变处理，经过粗筛和精筛，选出多糖含量明显高于原始菌株的新品种，经过10代的PDA培养基及摇瓶试验和多次3吨罐的中试试验，表明所得的诱变株确实在产量及多糖含量上超过原来菌株，从小试、中试的结果看该菌株的性状比较稳定。如罗立新等采用紫外线对灵芝菌进行了诱变处理，选育到一株高产菌株，其产菌体量和产胞外粗多糖量，分别比原菌株提高了21.3%和30.6%。
3.2 原生质体融合及基因工程技术
由于真菌的分子生物学研究开展较晚，尤其是大型药用真菌，目前人们对其的遗传背景和基因的表达调控尚不清，利用原生质体融合及基因工程等技术对大型药用真菌进行基因改变的研究还处于起步阶段。薛平海等对灰树花菌株原生质体制备及再生条件进行了研究，研究表明：液体摇瓶振荡培养7 d的菌丝，以0.6M的甘露醇作渗透压稳定剂，采用浓度为2 %的真菌溶壁酶，在pH5.5、30℃条件下酶解5h，原生质体制备率最高，可达6.6×10个／ml，并所得原生质体在两种不同的培养方式中均实现了再生。
4 发酵产物的分析测定
随着药用真菌液体深层发酵技术的发展，对发酵产物的分析测定方法也不断提高。
如：在利用薄层层析法进行灵芝有效成分的定性分析中，选用甲苯－乙酸乙酯～乙酸(12：14：0.5)为展开剂，以硫酸一甲醇(1：1)为显色剂，通过硅胶薄层层析法由灵芝发酵产物中分离得到三种四环三萜酸，并测定了这三种物质的紫外光谱。在云芝菌丝体提取物云芝糖肽中糖和蛋白质的含量及分子量测定中采用了快速、分辨率高和重现性好的高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)。在对天然和发酵培养冬虫夏草中的腺苷、尿苷、鸟苷等3种核苷类成分的含量的测定中采用了高效毛细管电泳法。
5 总结
利用发酵技术生产药用真菌食品、营养品，保健品、药品或其它生物制品将是药用真菌产业开发的新领域，有着十分广阔的发展前景。但是在药用真菌发酵研究中应当注意：a.加强优良菌种的选育工作，这是直接关系到液体深层发酵产物量、有效成分含量及有效性；b.加强发酵液优先成分分析，由于发酵产物成分含量复杂，不易把握其药用机理，不利于临床的进一步研究；c.积极改进和完善发酵设备及发酵技术；d.确定标准的发酵产物分析手段，采用现代化学方法，丰富质量鉴定内涵。
参考文献
[1]徐锦堂主编．中国药用真菌学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：235
[2]洪震等．食用药用苗实验技术厦发酵生产 北京：中国农业科技出版社．1992
[3]朱戎等．药用真菌液体发酵研究进展 中药材第26卷第1期2003年1月：55－57
[4]崔战利等 发酵技术在食(药)用菌上的应用概况 中国林副特产 NO2：33－34
[5]张颖等 液体发酵蜜环菌培养条件的优化及菌体多糖的分离.食用菌，2001.23（2）：7
[6]汪维云，等．灰树花液体深层培养-1-艺研究．生物工程学报.1999.15.（3）：378
[7]李刚．发酵灵芝菌粉和灵芝子实体中灵芝多糖含量的比较，中国食用菌，2000.19（1）：35
[8]宋爱荣，等．pH对灰树花液体深层发酵的影响．中国食用菌，1999.18（3）：29
[9]裘娟萍，等．灰树花深层发酵工艺条件的研究．微生物学通报，2001.28（3）：33
[10]李羿等．茯苓液体发酵条件的研究，成都中医药大学学报 Mar.2OO5，Vo1.28.No1：52－55
[11] 潘继红．灵芝液体培养营养需求的探讨．食用菌学报，1997，4(1)：31一43
