Related Strategies and Research Progress of Efficient expression of Heterologous Proteins in Pichia pastoris
朱 文，胡又佳，谢丽萍*
(中国医药工业研究总院张江分院，大分子药物创新中心，上海 201203)
摘要：蛋白类药物和工业酶的异源表达在各类生物制药产业和工业应用中具有重要意义。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 作为最为成功的真核蛋白表达系统之一，近 20 年来经历飞速发展并受到广泛关注，产生了巨大的经济和社会价值。但另一方面，由于该系统受到包括外源基因本身特性、菌种特性、表达环境以及发酵工艺等在内的诸多因素的影响，其对于不同外源蛋白的表达情况也表现出较大差异。为解决这一难题，研究人员尝试使用了各种策略，如密码子优化、高拷贝菌株筛选、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因和甘油运转体基因、共表达促折叠因子和透明颤菌血红蛋白，以及诱导条件、辅助表达物添加和发酵工艺的优化。本文对提高此系统外源蛋白表达量的相关策略及产业化研究进展进行了综述，并简要展望此系统的产业化发展前景。
关键词：毕赤酵母；外源蛋白；药用蛋白；工业酶；高效表达
以下为文章节选
1 毕赤酵母表达系统优势及发展现状随着肿瘤以及各类慢性疾病的不断蔓延，蛋白类药物在人类疾病治疗和保健过程中发挥着日益显著的作用。在工业应用中，各类酶制剂也越来越广泛。为了以更高效、稳定、经济的方式生产这些药用蛋白及工业酶，科研人员研发出一系列高效的外源蛋白表达系统[1]。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 作为其中的重要一员，其异源蛋白表达历史可追溯至1987 年。
相比大肠埃希菌(Escherichia coli) 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 等传统原核表达体系，毕赤酵母具备如下显著优势。①蛋白表达量高。毕赤酵母的甲醇代谢启动子AOX1 是已知效果最强的启动子之一，在甲醇充分诱导下，AOX1 转录产物占整个细胞转录产物的30％以上，相当多的外源蛋白的表达量达到g/L 级别( 表1)。②分泌效率高。与在原核表达系统中易形成难复性、难纯化、活性低的包涵体不同，外源蛋白在毕赤酵母中通常能够得到较好的分泌。③较为完备的后加工处理能力。作为真核表达系统，毕赤酵母能够为外源蛋白的折叠、糖基化及其他后加工过程提供较为适宜的环境和条件。④稳定性高。外源蛋白的基因通常以同源重组的方式整合在毕赤酵母基因组中，不需要外界抗生素等筛选压力的维持即能自行保持稳定[17]。
与动植物细胞及转基因动植物表达系统相比，毕赤酵母的优势则更集中在产业化潜力方面。①遗传操作更为简单。毕赤酵母的遗传背景清晰，代谢通路相比动植物而言更为简洁。②培养成本低。毕赤酵母能在以甘油或甲醇为唯一碳源的廉价基础盐培养基中生长并表达外源蛋白，产业化成本较低[12]。③高密度发酵。在仅使用甲醇作为碳源和诱导剂的情况下，毕赤酵母的菌体干重可达到100 g/L水平，远超过动植物细胞[18]。由于具备以上多个优势，现已有超过500 种不同来源的蛋白在毕赤酵母中实现了表达，其中不乏已实现产业化的、表达量较高的药用蛋白和工业酶( 表2)。
然而毕赤酵母系统也有自身的一些劣势，主要包括以下几方面。①糖基化缺失。毕赤酵母系统中缺乏相应的糖基化酶，某些在糖基化后方可实现其完整功能的蛋白无法使用此系统表达。②生产时间长。毕赤酵母系统所使用的诱导剂为甲醇，而毕赤酵母对甲醇的利用率和同化效率都较低，其菌体生物量在诱导阶段增长十分缓慢，过量的甲醇积累甚至会对菌体产生一定毒性。与此相应，目标蛋白在诱导阶段的积累速度也较慢，导致生产时间较长。③对溶氧要求高。毕赤酵母为好氧微生物，甲醇的代谢也需要大量的氧气，这直接导致溶氧成为生产过程中的限制因素。相应的策略为通入纯氧或将发酵装置的搅拌系统维持在较高转速，这无疑增加了目标蛋白的生产成本。④甲醇的安全隐患。毕赤酵母在表达外源蛋白时需要大量甲醇作为碳源和诱导剂，大量甲醇的长时间储存带来了安全隐患。除上述所述的劣势外，毕赤酵母对不同蛋白甚至同一蛋白的表达量也存在很大差异。如人血清白蛋白，在毕赤酵母中的表达量为1.4 ～ 11 g/L，而耻骨松弛激素和骆驼抗体重链的表达量仅为10 和5 mg/L[2,6,19—20]。究其原因，外源蛋白在毕赤酵母系统内的表达受到一系列因素的影响，如上游包括密码子适应性在内的外源基因本身特性、包括分泌效率在内的菌种特性，以及下游的培养环境因素、辅助表达物的添加以及包括补料方式在内的发酵工艺等。本文将从这些影响因素出发，对提高外源蛋白在毕赤酵母中表达量的相关策略进行综述( 图1)，以期对药用蛋白和工业酶的产业化提供一些有益的
参考。
2 高效表达外源蛋白的分子水平策略
2.1 外源基因改造
从外源基因改造的角度出发，主要包括对外源基因密码子的优化、外源基因整合拷贝数的增加以及引导肽的选择。
2.1.1 密码子优化
由于毕赤酵母与目标蛋白来源宿主具有种属差异，外源蛋白在毕赤酵母中的表达通常在一定程度上受到相应tRNA 匮乏的不良影响。密码子优化，即在保证目标蛋白氨基酸序列不变的基础上将外源基因的密码子优化为毕赤酵母偏嗜类型，往往能大幅度提高外源蛋白的表达量。Tu 等利用密码子全优化策略，将猪圆环病毒2 型衣壳蛋白在毕赤酵母中的表达量由低至不可测提升至174 mg/L[21]。Yang等利用近年来兴起的密码子理性优化策略，将来源于黑曲霉的2 型脂肪酶在毕赤酵母中的表达量由16.5 u/L 提升至191 u/L，提升幅度超过10 倍[22]。
2.1.2 拷贝数增加
外源蛋白的表达量通常与插入的外源基因拷贝数成正相关，提高外源基因拷贝数，即为一个快速获取高产菌株的有效方法。Wang 等构建并筛选出携带不同拷贝蝎毒镇痛活性肽的毕赤酵母菌株，并测量其目标蛋白表达量，结果表明四拷贝菌株的表达量显著高于单、双拷贝菌株[16]。值得一提的是，此相关性仅在一定范围内成立。Wu 等报道在毕赤酵母中表达内质网氧化物蛋白时，外源基因的拷贝数超过5 反而会出现表达量大幅下降的情况[9]。可见随着外源基因拷贝数的增加，菌株的转录及翻译负担也加重，从而不利于外源蛋白表达。
2.1.3 引导肽的选择
引导肽为外源蛋白基因初级翻译产物中负责蛋白分泌的肽段，高效的引导肽将表达出的蛋白及时分泌出细胞，能在缓解胞内蛋白积累压力的同时提高蛋白产量，故引导肽的选择对外源蛋白产量的提高至关重要。目前，毕赤酵母中使用的主流引导肽包括α- 引导肽、重组人中期因子引导肽以及酸性磷酸酶引导肽，而其中又以α- 引导肽的效率最高，因而使用最为广泛，是毕赤酵母系统的首选引导肽[25]。然而针对不同蛋白，仍需进一步试验确定最佳的引导肽。文献报道在利用毕赤酵母表达HIV抗体时，小鼠IgG1 信号肽的诱导分泌效果显著优于α- 引导肽[26]。
2.2 菌种改造
从菌种改造的角度出发，主要包括敲除蛋白降解酶基因、导入促折叠因子、导入透明颤菌血红蛋白(Vgb) 基因，以及敲除甘油运转体基因。
2.2.1 敲除蛋白降解酶基因
Sazonova 等证实毕赤酵母的Yapsins 蛋白酶系( YPS1 ～ YPS7) 会对外源蛋白产生一定程度的降解作用，并在敲除YPS1 基因后，考察了蛋白酶缺陷菌株的生长特性及蛋白表达量。结果表明，YPS1缺陷菌株在生长特性上与原始菌株没有显著差异，且蛋白表达量有所提升[27]。Wu 等构建了YPS1 和PEP4 双敲除毕赤酵母菌株，将人血清白蛋白与人甲状旁腺激素串联蛋白的完整片段在总蛋白中的比例由30％提高至80％ [28]。现阶段，已有商业化的蛋白酶敲除毕赤酵母菌株在售，可有效防止外源蛋白在分泌后降解，从而提高蛋白表达量。
2.2.2 导入促折叠因子基因
即使有各类高效引导肽可供选择，外源蛋白在毕赤酵母胞内滞留的情况依旧常见，在表达量较高时更是如此。当大量的外源蛋白在胞内合成完毕而不能及时完成相应折叠时，会造成内质网的压力，并进一步引起外源蛋白的胞内降解。促折叠因子基因的导入能使得菌株过表达促折叠因子，加速大量外源蛋白的及时折叠和分泌，对提高蛋白产量有直接推动作用。Sha 等报道通过在毕赤酵母中共表达促折叠因子ERO1p 和PDI 基因，可将重组脂肪酶r27RCL 的时空产率由950 u·(g·h)-1 提高到1 450 u·(g·h)-1[29]。但此类促折叠因子的表达也会占用一定的细胞资源，其实际的促折叠效果以及最佳促分泌剂量仍需试验探索。
2.2.3 导入Vgb 基因
毕赤酵母作为一种需氧真核生物，其生长十分旺盛，尤其在生长后期，其菌体浓度很高时，会快速消耗发酵液中的氧气。另一方面，甲醇作为唯一的蛋白表达诱导剂，其代谢的过程对氧气含量也有较高要求。据统计，即使代谢较低浓度(4 g/L) 的甲醇，需氧量也高达2 mol·(L·h)-1，而目前大规模发酵设备的氧气传质速率却仅为0.3 mol·(L·h) -1，无法满足菌体的需氧量。部分实验室及工厂采取通入纯氧或纯氧/ 空气联合通入的策略，但这无疑增加了安全隐患，同时也提高了外源蛋白的生产成本。
2.2.4 敲除甘油转运体基因
在外源蛋白表达过程中，甲醇代谢启动子AOX1 的诱导状况对蛋白的表达至关重要，而即便极微量的甘油也会对这一启动子形成抑制效应。在敲除部分甘油运转体基因后，菌体将甘油从胞外运转至胞内的过程受阻，胞内甘油浓度降低，可在一定程度上解除甘油对AOX1 的抑制作用，从而提高外源蛋白表达量。张震阳等构建了甘油转运体GT2缺失酵母菌株，观察到以甘油为唯一碳源时，其生长速度相对于对照菌株慢。但以甘油- 甲醇作为混和碳源时，敲除菌株能够在保持良好菌体生长的同时表现出高于对照菌株35％的AOX1 酶活力，而
荧光蛋白表达强度相比后者更是有70％的提升[33]。
3 高效表达外源蛋白的发酵水平策略
3.1 环境参数优化
在诸多影响毕赤酵母系统表达效率的环境因素中，温度和溶氧水平是较为重要的2 个参数。
3.1.1 温度优化
毕赤酵母能够在20 ～ 32 ℃的范围内生长，但其最佳生长温度约28 ℃，这也是发酵前期积累生物量最常用的温度。但对于外源蛋白的表达而言，最佳温度则需进一步的试验摸索。总体来说，低温更有利于蛋白的表达、折叠，并通过降低蛋白酶的活性间接提高蛋白产量。Jia 等在利用毕赤酵母表达截短聚乙烯醇脱氢酶时观察到，重组菌在28 ℃时无法承受高浓度的甲醇，但在22 ℃时其AOX1酶活力及细胞活率显著更高，蛋白酶活性也更低，最终蛋白产量高于对照组(28 ℃ )[34]。作者推测在高温时毕赤酵母过快代谢甲醇，从而造成有害物质迅速积累，并进一步损害细胞活力。而Avelar 等利用毕赤酵母表达粗毛革孔菌漆酶时观察到，将诱导温度降至20 ℃，几乎检测不到目标蛋白的表达[35]。可见，温度参数仍需在高细胞活力和有利的蛋白表达折叠环境之间取得平衡。
3.1.2 溶氧水平优化
当溶氧水平过低时，毕赤酵母的有氧呼吸受抑，细胞活力降低，甲醇代谢受阻，造成过多的甲醇积累；而当溶氧水平过高时，易引起“氧中毒”现象，同时高的溶氧水平也提高了通气及搅拌设备的运转成本。通常，溶氧水平维持在10％～ 30％较为适宜。梁克学等利用毕赤酵母表达猪圆环病毒Cap 蛋白时观察到，将溶氧水平由20％降至10％时，蛋白产量由54 mg/L 提高至198 mg/L[36]。Lopes 等通过将罐内压由100 kPa 提高至500 kPa 来增强氧气传输，从而将分泌总蛋白的浓度由40 mg/L 提高至140 mg/L[37]。但这种提高罐内压的策略仅停留在实验室阶段，较高的设备运行成本及运行风险将会影响其在产业化规模生产上的应用。
3.2 添加辅助表达物
大量研究结果表明，在诱导期间添加一定量的某些组分，如非抑制性碳源、维生素C、某些氨基酸和油酸等辅助表达物，能够促进菌体的生长或蛋白的表达，从而提高目标蛋白在毕赤酵母表达系统中的产量。
3.2.1 共补碳源
在表达外源蛋白的诱导阶段，甲醇同时作为唯一碳源和诱导剂。一方面，甲醇作为唯一碳源时，其代谢过程需要消耗大量氧气，生物量增长速度较为缓慢；另一方面，作为碳源的这部分甲醇无法充分实现其诱导效果。部分研究人员采取在诱导阶段联用非抑制性碳源( 如山梨醇、甘露醇) 与甲醇作为共补碳源的策略。在此策略中，非抑制性碳源为细胞提供碳原子骨架及能量，而甲醇负责诱导，往往能获得更高的生物量及蛋白产量。Fang 等在毕赤酵母中表达嗜热真菌脂肪酶时观察到，与单独补甲醇组相比，甲醇- 山梨醇共补将菌体湿重由420 g/L提高到490 g/L，蛋白产量由3.3 g/L 提高到4.0 g/L[38]。此外，甘露醇也具有较好的促表达效果。李光磊等利用毕赤酵母表达嗜麦芽寡养单胞菌角蛋白酶时观察到，相比单独补甲醇组而言，甲醇- 山梨醇共补将菌体生物量和蛋白产量分别提升了23％和34％，而甲醇- 甘露醇共补时，菌体生物量仅增加0.4％，但目标蛋白产量却提升了87％ [39]。共补碳源策略有效提高了菌体活力，增加了生物量，同时增强了甲醇的诱导效果，从多个方面促进了外源蛋白的表达。
3.2.2 添加维生素C
在诱导阶段，甲醇的持续氧化代谢会造成胞内还原力匮乏，从而降低细胞活力，维生素C 作为一种应用广泛的抗氧化剂，能有效缓解胞内还原力的匮乏。Noseda 等报道在利用毕赤酵母表达牛凝乳酶B 时，添加10 mmol/L 维生素C 即可将目标蛋白的产量由3 IMCU/ml( 对照组) 提高至6 IMCU/ml[40]。
3.2.3 添加氨基酸
外源蛋白的大量表达会快速消耗发酵液中的氮源，易造成某些种类氨基酸的匮乏，对外源蛋白的表达产生直接的不利影响。若及时补充相应氨基酸，特别是外源蛋白中比例较高的氨基酸，外源蛋白的产量很可能得到提高。Wang 等报道在毕赤酵母中表达耐热耐碱漆酶时，相比不添加氨基酸的对照组，添加1.2％丙氨酸能将目标蛋白的浓度由70 u/L 提高到330 u/L[41]。此外，氨基酸的添加不仅为外源蛋白的表达提供了直接的合成材料，同时也为细胞提供了部分有机氮源。
3.2.4 添加油酸
毕赤酵母基因组中负责甲醇代谢的基因有AOX1 和AOX2，尽管AOX2 的活性低于AOX1，但它也有部分诱导效果。作为对AOX2 启动子具有很强促启动作用的物质之一，油酸具有潜在的促进外源蛋白表达的效果。Kobayashi 等报道在利用毕赤酵母表达人血清白蛋白时添加0.01％和0.05％的油酸，可以在不影响菌体生物量的前提下将白蛋白产量提高1 倍[42]。但另一方面，油酸具有一定的消泡效果，可能会对发酵液中的溶氧造成一定的影响，其促进蛋白表达的最佳剂量也需试验探索。
3.3 发酵工艺优化
针对毕赤酵母表达系统的发酵工艺优化主要集中于对起始诱导菌体量和甲醇补料方式的研究，这两者是较为重要的工艺参数。
3.3.1 起始诱导菌体量优化
毕赤酵母表达外源蛋白一般分为2 个阶段，第一阶段以甘油为碳源积累生物量，第二阶段以甲醇为碳源诱导外源蛋白表达，但关于实际生产中以多少生物量为临界点起始诱导，尚无定论。Mallem 等在研究起始诱导菌体量对白蛋白在毕赤酵母中产量的影响时观察到，将起始诱导菌体湿重由150 g/L提高到230 g/L 时，白蛋白表达量由4.8 g/L 提高到8 g/L ；而将起始诱导湿重进一步提高到285 g/L 时，表达同样浓度的白蛋白所需的诱导时间由335 h 缩短至240 h，时空产率提高了约50％ [8]。Adivitiya等在毕赤酵母中表达链激酶的研究中观察到，OD值为20 时比OD 值为10 时起始诱导的蛋白表达量高出约20％ [10]。但另一方面，更大的起始诱导菌体量意味着菌体积累阶段更多的碳源投入以及菌体积累时间的延长，直接增加了外源蛋白生产的时间和经济成本。
3.3.2 改进甲醇补料方式
发酵液中甲醇浓度对毕赤酵母的细胞活力及蛋白表达有显著影响，而在发酵罐水平上，甲醇补料方式将直接决定发酵液中的甲醇浓度。目前采取的甲醇补料方式主要包括恒速补料、指数补料、溶氧反馈补料及计算机辅助设计补料。其中，恒速补料在菌体量较少的诱导前期易造成甲醇积累，而在菌体量较高的后期又易造成甲醇匮乏；溶氧反馈补料能有效防止过多甲醇积累，但由于溶氧监测、反馈系统及补料设备的整体延后，此策略下的溶氧波动幅度非常大，不利于细胞生长和表达。相比而言，指数补料和计算机辅助设计补料策略则能根据罐内的实时生物量和生长趋势进行补料，更有利于外源蛋白的表达。Kobayashi 等利用计算机辅助设计补料，在毕赤酵母发酵液中获得了7 g/L 的人血清白蛋白[3]，并在随后通过进一步优化此策略，将表达量提升至11 g/L[6]。相信随着计算机建模和数据处理能力的不断加强，计算机辅助设计补料将会逐渐成为主流的补料方式。
4 展望
随着蛋白类药物及工业酶的兴起，各类高效蛋白表达体系也随之取得了快速发展。巴斯德毕赤酵母作为一种成熟的外源蛋白表达系统，已实现了500 多种外源蛋白的表达，其多个优良的表达特性也早已得到广泛验证，如表达量高、分泌效率高、遗传操作简单、培养成本低、产业化较为容易等。目前，针对外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达而对这一系统进行优化改造的研究工作正如火如荼地进行。一方面，在分子水平上对外源基因进行改造，能够大大提高外源基因和表达菌株的适配性，以较低的时间和经济成本实现产量的大幅增加。随着分子生物学的发展，研究人员对菌种生理特性的认识和理解日益深入，对菌种实施分子操作和改造的能力也越来越强。在不久的将来，研究人员会从更多的切入点、以更高效的分子操作方法和工具对毕赤酵母表达菌株实施改造，以期获得更优秀的生产菌株。而另一方面，在小规模初期研究时，通过设计多组平行试验探索出最佳或接近最佳的环境参数以及多种辅助表达物的添加，可为后期的大规模放大生产奠定坚实的基础。毕赤酵母表达系统的菌体密度极高，诱导时间较长，发酵工艺对外源蛋白表达的影响贯穿整个生产过程。随着研究人员对菌种代谢特性理解的加深、对发酵过程中各个参数及环节的监控手段的逐渐丰富以及发酵生产理念的日益更新，我们有理由相信，更科学、更先进、更合理的发酵工艺也会不断涌现。可以肯定，毕赤酵母作为一种潜力巨大的表达系统，对药用蛋白和工业酶的研发和生产会产生重要的推动作用。
作者简介：朱 文(1992—)，男，硕士研究生，专业方向：微生物与生化药学。
E-mail：zhuwen8080@foxmail.com
通信联系人：谢丽萍(1977—)，女，研究员，从事重组蛋白和多肽药物的研发、天然药物的生物合成研究。
Tel：021-20572000×4040
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